Gadd45a在人腦膠質瘤細胞中的表達及其與細胞凋亡及增殖的關系

冀秀英 王艷梅 白 洋 梁麗梅 (吉林省精神神經病醫院，吉林 四平 6000)

腦膠質瘤是由于大腦和脊髓膠質細胞癌變所產生的、最常見的原發性顱腦腫瘤。如同其他腫瘤(疾病)一樣，膠質瘤也是由于先天的遺傳高危因素和環境的致癌因素相互作用所導致的。Gadd45a細胞受到輻射等外界因素刺激DNA受到損傷后而表達的基因，Gadd45a基因高表達后可以通過阻滯細胞周期在G2-M期、修復DNA、促進細胞凋亡等保留大部分細胞的存活，而減少細胞癌變的可能。目前研究表明，Gadd45a基因異常表達與乳腺癌、胰腺癌、肺癌及前列腺癌密切相關〔1～5〕。本文探討Gadd45a在人腦膠質瘤細胞中的表達及其與細胞凋亡及增殖的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 膠質瘤細胞系U251細胞購自上海科興生物科技有限公司;正常腦組織來自我院神經外科手術切除組織;胎牛血清、annexinⅤ、PI、MTT試劑購自 Hyclone公司;M-MLV逆轉錄酶購自Promega公司;流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 腦組織制備單細胞懸液的方法 將大腦組織置于事先消毒好的200目細胞篩(下接容器)，用玻璃棒輕輕研磨腦組織，使其變成單個細胞，待研碎后用生理鹽水或培養液沖洗，細胞篩下容器內所盛溶液為單細胞懸液。用吸管吹打均勻后離心，1 000 r/min，5 min，傾出上清，如此沖洗1～2次后加生理鹽水或培養液，制成單個腦細胞懸液，用于實驗。

1.2.2 RT-PCR方法檢測Gadd45a mRNA在細胞中的表達根據RT-PCR試劑盒說明書，提取正常腦組織神經細胞和U251細胞中的總RNA進行PCR反應。選擇GAPDH作為內參照。Gadd45a上游引物:5'TTACATTGGCAAGTT3'，下游引物:5'C GCGCCGAATTCAT3'，342 bp;GAPDH 上游引物:5'GGATTCGCCATTACT3'，下游引物:5'AGGATTAGCTT3'，520 bp。PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.15 g/L溴乙啶)分離后，用DEL2000凝膠成像分析系統拍照分析。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率 將正常腦組織神經細胞和U251細胞在6孔板內培養，接種密度4×105ml－1，培養至細胞匯合后，PBS液清洗經消化收集的細胞2～3次，調整細胞密度為1×106ml－1，將細胞懸液100 μl轉移至試管中;加入FITC標記的annexinⅤ和PI溶液，輕輕混勻;室溫避光放置10～15 min;加入400 μl緩沖液，將全部液體轉移至FCM分析用試管，用FCM進行細胞周期分析，采用Becton Dickinson公司的Cell Fit進行自動分析，統計細胞周期各個時相所占比例及凋亡情況。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖情況 單細胞懸液接種于96孔培養板;103～104細胞/孔，每孔培養基總量200 μl(96孔培養板每孔容積370 μl)，37℃、5%CO2培養箱中培養 24 h，加入2 mg/ml MTT液(50 μl/孔);繼續培養3 h。吸出孔內培養液后，加入DMSO液(150 μl/孔)，將培養板置于微孔板扳蕩器上振蕩10 min，使結晶物溶解。酶標儀檢測各孔OD值(檢測波長570 nm)。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行組間t檢驗。

2 結果

2.1 各組細胞Gadd45a mRNA表達 正常人腦組織神經細胞中的Gadd45a mRNA表達水平明顯高于U251細胞Gadd45a mRNA表達水平(P＜0.05)。見圖1。

2.2 各組細胞的細胞周期比例 U251細胞在S期比例明顯高于正常人腦神經細胞，G2～M期細胞比率明顯降低正常人腦神經細胞(P＜0.05)。見表1。

圖1 各組細胞Gadd45a mRNA表達

表1 各組細胞的細胞周期比例(n=5，%，±s)

表1 各組細胞的細胞周期比例(n=5，%，±s)

與正常腦神經細胞比較:1)P＜0.05

組別 G0～G1期 S期 G2～M期正常腦神經細胞42.21±2.67 45.94±2.91 11.85±1.55 U251細胞 27.32±2.23 70.95±2.441) 1.73±0.971)

2.3 各組細胞凋亡率 U251細胞凋亡率(17.81%±1.65%)明顯低于正常人腦神經細胞(43.74% ±2.32%，P＜0.05)。

2.4 各組細胞增殖情況 U251細胞增殖率(77.12%±2.37%)明顯高于正常人腦神經細胞(21.74% ±1.21%，P＜0.05)。

3 討論

腫瘤是機體在各種因素作用下，局部組織的細胞在基因水平上失去了對其生長的正常調控，導致細胞的異常增生而形成的新生物。腫瘤是基因疾病，其生物學基礎是基因的異常。致瘤因素使體細胞基因突變，導致正常基因失常，基因表達紊亂，從而影響細胞的生物學活性與遺傳特性，形成了與正常細胞在形態、代謝與功能上均有所不同的腫瘤細胞。腫瘤的發生是多基因、多步驟突變的結果。不同的基因的突變與不同強度的突變形成了不同的腫瘤。Gadd45基因是生長抑制及DNA損傷誘導基因家族中的一員，是電離輻射效應基因之一，在細胞周期調控、DNA損傷修復及細胞凋亡過程中發揮重要作用，這使它成為維持基因組穩定性的重要基因，在腫瘤細胞存活、凋亡信號通路中發揮錯綜復雜的作用，從而參與腫瘤的發生和發展。研究顯示Gadd45a介導的生長抑制與Gadd45a對細胞周期G2～M期監測點和細胞凋亡的調控密切相關〔6〕。研究表明，Gadd45a進入細胞核內后與細胞周期分裂相關基因2(Cdc2)結合，形成Gadd45a/Cdc2復合體，由于此復合體不具有細胞周期依賴性激酶的作用，因此細胞無法由G2期進入M期，從而導致細胞停滯在G2～M期〔7〕。同時有研究結果顯示，在Gadd45a基因敲除的上皮細胞，在紫外線輻射后，細胞凋亡受到抑制，提示，Gadd45a可以促進細胞凋亡〔8〕。本文結果顯示，Gadd45a基因在腦膠質瘤細胞中的表達明顯下調，同時伴隨腦膠質瘤細胞周期停滯在G2～M期，細胞凋亡率明顯下降，增殖能力增強，與上述結果一致，證實Gadd45a基因作為機體的保護性基因，其表達缺失或下降，直接參與腦膠質瘤的發生與發展。因此，針對Gadd45a基因的靶向性研究可以成為腦膠質瘤治療學方面的重點。

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2 Tront JS，Hoffman B，Liebermann DA.Gadd45a alpha is highly expressed in pancreatic ductal adenocarcinoma cells and required for tumor cell viability〔J〕.Int J Cancer，2006;118(10):2405-11.

3 Sensi E，Tancredi M，Aretini P，et al.Clinicalpathological significance of GADD45 gene alternations in human familial breast carcinoma〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2004;87(2):197-201.

4 Wang W，Huper G，Guo Y，et al.Analysis of methylation sensitive transcriptome identifies Gadd45a as a frequently methylated gene in breast cancer〔J〕.Oncogene，2005;24(16):2705-14.

5 Oki T，Sowa Y，Hirose T，et al.Genistein induces Gadd45 gene and G2/M cell cycle arrest in the DU145 human prostate cancer cell line〔J〕.FEBS Lett，2004;577(1-2):55-9.

6 姬峻芳，吳 旻，詹啟敏，等.Gadd45a在抑制細胞轉化和腫瘤惡性進展中的作用〔J〕.生物化學與生物物理進展，2006;33(12):1146-53.

7 Gao H，Jin S，Song Y，et al.B23 regulates GADD45a nuclear translocation and contributes to Gadd45a-induced cell cycle G2-M arrest〔J〕.J Biol Chem，2005;280(12):10988-96.

8 Higashi H，Vallbohmer D，Warnecke-Eberz U，et al.Down-regulation of Gadd45 expression is tumor differentiation in non-small cell lung cancer〔J〕.Anticancer Res，2006;26(3A):2143-7.