LncRNA FAM225A靶向miR-1-3p基因調控結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡

陳文霞 劉艷紅 肖興國 張磊 王琳 吳慧麗

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院消化內科，河南 鄭州 450007)

結直腸癌(CRC)是消化道常見的惡性腫瘤之一，手術及放化療雖改善了CRC患者總體存活率，但仍需尋找新的療效更好的治療手段，針對CRC發病特點的定點靶向治療對CRC的治療和預后具有重要意義〔1，2〕。研究發現LncRNA參與了CRC的發生發展，可為CRC診斷和治療提供新手段〔3〕。有研究報道LncRNA FAM225A在慢性阻塞性肺疾病患者中表達上調〔4〕。FAM225A在胃癌細胞中也高表達，與胃癌的發生發展可能相關〔5〕。然而FAM225A在CRC中的表達及其對CRC細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響也尚未清楚。研究發現miRNA也與CRC進展有關〔6〕。有報道發現miR-1-3p在CRC中顯著下調，且可能通過多種生物學方法抑制CRC〔7〕。上調miR-1-3p抑制膀胱癌細胞的增殖，遷移和侵襲〔8〕。過表達miR-1-3p靶向抑制腦源性神經營養因子(BDNF)的表達，抑制酪氨酸激酶B(TrkB)的磷酸化從而抑制人滋養細胞增殖和侵襲〔9〕。然而miR-1-3p對CRC細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及FAM225A是否通過miR-1-3p影響CRC的生物學行為還尚未清楚。本研究旨在探討FAM225A和miR-1-3p對CRC細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及FAM225A是否通過miR-1-3p影響CRC的生物學行為。

1 材料與方法

1.1材料 正常人胚胎結腸細胞FHC和CRC細胞株SW480、HCT116購自美國菌種保藏中心(ATCC)。RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa；四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自日本同仁研究所；蛋白裂解液購自上海碧云天；兔抗人細胞周期蛋白(Cyclin)D1多克隆抗體、兔抗人裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3多克隆抗體、兔抗人基質金屬蛋白酶(MMP)-2多克隆抗體、兔抗人MMP-9多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體和山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)購自艾美捷科技有限公司；Transwell小室、基質膠購自美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國AAT Bioquest。si-NC、si-FAM225A、miR-NC、miR-1-3p、pcDNA-NC、pcDNA-FAM225A、anti-miR-NC、anti-miR-1-3p載體質粒購自北京普瑞金科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組 正常人胚胎結腸細胞FHC和CRC細胞SW480、HCT116用RPMI1640培養基常規培養；取對數生長期細胞SW480、HCT116，將FAM225A干擾表達載體及陰性對照、miR-1-3p模擬物及陰性對照分別轉染至SW480、HCT116細胞中，記為si-FAM225A組、si-NC組、miR-1-3p組、miR-NC組；將FAM225A干擾表達載體分別與miR-1-3p抑制劑及陰性對照共轉染至SW480、HCT116細胞中，記為si-FAM225A+anti-miR-1-3p組、si-FAM225A+anti-miR-NC組；正常培養的細胞作為空白對照(control)組。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測FAM225A和miR-1-3p表達水平 收集細胞，提取總RNA，合成cDNA后進行PCR，以β-actin和U6為內參，用2-△△Ct法計算相對表達量。FAM225A上游引物：5′-ATATAGTCCTGGGCCCCATC-3′，下游引物：5′-TTCGACACAGGCAGTTTCAC-3′；β-actin上游引物：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′；miR-1-3p上游引物：5′-ACACTCCAGGTGGGTGGAATGT-3′；下游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAG-3′。U6上游引物：5′-CGCTTCGGCACATATAC-3′，下游引物：5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2.3MTT檢測細胞存活率 各組細胞培養48 h，按試劑盒說明操作，最后檢測490 nm處吸光度(OD)值。將control組存活率設為100%，計算其他各組細胞存活率。

1.2.4克隆形成實驗檢測細胞生長情況 各組細胞消化后接種于細胞培養板中，培養2 w，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去上清液，用4%多聚甲醛固定15 min，加適量Giemsa染色10～30 min，洗去染色液，干燥后在顯微鏡下計數。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，按試劑盒說明書操作，上流式細胞儀檢測。

1.2.6Western印跡法檢測CyclinD1、裂解caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平 收集各組細胞，提取總蛋白，制備電泳凝膠，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(電壓80 V，樣品進入分離膠后，電壓調為150 V，繼續電泳1 h)，轉膜(150 mA，2 h)，置于封閉液中室溫輕搖1 h；將膜置于含有一抗的雜交袋中，置于搖床上4℃輕搖過夜。膜漂洗3次后置于含二抗的雜交袋中，室溫輕搖2 h，顯影，漂洗、晾干后拍照，分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內參計算蛋白相對表達水平。

1.2.7Transwell檢測細胞遷移和侵襲 用無血清培養液重懸各組細胞，取100 μl接種于Transwell上室，下室加含血清培養液，培養48 h，棄去培養液，棉簽擦去上層細胞，甲醛固定，加入結晶紫染色30 min，漂洗干燥，顯微鏡下觀察并計數。侵襲：用基質膠包被Transwell上室，其余同遷移實驗。

1.2.8熒光素酶報告基因檢測實驗檢測FAM225A對miR-1-3p的靶向調控 將FAM225A野生型和突變型基因靶點熒光素酶表達載體分別與miR-NC和miR-1-3p共轉染至SW480、HCT116細胞中。按照說明書進行檢測。將si-NC、si-FAM225A、pcDNA-NC、pcDNA-FAM225A分別轉染至SW480、HCT116細胞中，用qRT-PCR檢測miR-1-3p表達水平。

1.2.9統計學方法 采用SPSS20.00軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1CRC細胞和正常人胚胎結腸細胞中FAM225A和miR-1-3p的表達 與正常人胚胎結腸細胞FHC相比，CRC細胞SW480、HCT116中FAM225A表達水平顯著升高，miR-1-3p表達水平顯著降低(均P<0.05)，見表1。可見，CRC細胞中，FAM225A高表達，miR-1-3p低表達。

表1 qRT-PCR檢測CRC細胞和正常人胚胎結腸細胞中FAM225A和miR-1-3p的表達水平比較

2.2低表達FAM225A基因抑制CRC細胞SW480、HCT116增殖、誘導凋亡 與si-NC組相比，si-FAM225A組CRC細胞SW480、HCT116中FAM225A表達水平顯著降低，細胞存活率及CyclinD1表達水平顯著降低，克隆形成細胞數目顯著減少，細胞凋亡率及裂解caspase-3表達水平顯著升高(均P<0.05)，見圖1、圖2、表2、表3、圖3。可見，低表達FAM225A抑制CRC細胞增殖、誘導細胞凋亡。

圖1 低表達FAM225A后克隆形成實驗

圖2 低表達FAM225A后CyclinD1、裂解caspase-3的表達

圖3 流式細胞儀檢測低表達FAM225A后細胞凋亡

2.3低表達FAM225A基因抑制CRC細胞SW480、HCT116遷移和侵襲 與si-NC組相比，si-FAM225A組CRC細胞SW480、HCT116遷移和侵襲數目顯著減少，MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低(均P<0.05)，見圖4、圖5、表4、表5。可見，低表達FAM225A抑制CRC細胞遷移和侵襲。

圖4 Transwell檢測CRC細胞的遷移和侵襲(結晶紫染色，×200)

圖5 Western印跡檢測MMP-2和MMP-9蛋白表達量

表4 低表達FAM225A抑制CRC細胞SW480的遷移、侵襲

表5 低表達FAM225A抑制CRC細胞HCT116的遷移、侵襲

2.4miR-1-3p高表達抑制SW480、HCT116細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡 與miR-NC組相比，miR-1-3p組miR-1-3p表達水平顯著升高，細胞存活率及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，克隆形成細胞數目及遷移和侵襲數目均顯著減少，細胞凋亡率及裂解caspase-3表達水平顯著升高(均P<0.05)，見圖6～9，表6、表7。可見，miR-1-3p高表達抑制SW480、HCT116細胞增殖、遷移、侵襲，誘導細胞凋亡。

圖7 miR-1-3p高表達促進細胞凋亡

圖8 miR-1-3p高表達抑制細胞遷移和侵襲(結晶紫染色，×200)

圖9 miR-1-3p高表達對相關蛋白表達的影響

2.5LncRNA FAM225A靶向調控miR-1-3p的表達 starbase預測顯示FAM225A與miR-1-3p有結合位點，圖10。相較于miR-NC組，轉染miR-1-3p與FAM225A野生型表達載體的細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，見表8、表9。相比于si-NC組，si-LncRNA FAM225A組CRC細胞SW480、HCT116中miR-1-3p表達水平顯著升高；相比于pcDNA-NC組，pcDNA-LncRNA FAM225A組CRC細胞SW480、HCT116中miR-1-3p表達水平顯著降低(均P<0.05)。見表10。可見，FAM225A可靶向調控miR-1-3p的表達。

圖10 生物信息軟件預測miR-1-3p與LncRNA FAM225A靶向關系

表8 miR-NC或miR-1-3p與LncRNA FAM225A -野生型及突變型報告質粒共轉染SW480細胞后相對雙熒光素酶活性檢測

表9 miR-NC或miR-1-3p與LncRNA FAM225A -野生型及突變型報告質粒共轉染HCT116細胞后相對雙熒光素酶活性檢測

表10 qRT-PCR檢測miR-1-3p水平

與si-NC組比較：1)P<0.05；與pcDNA-NC組比較：2)P<0.05

2.6miR-1-3p低表達可部分逆轉FAM225A低表達對CRC細胞SW480、HCT116增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與si-FAM225A+anti-miR-NC組相比，si-FAM225A+anti-miR-1-3p組細胞存活率及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著升高，克隆形成細胞數目及遷移和侵襲數目均顯著增加，細胞凋亡率及裂解caspase-3表達水平顯著降低(均P<0.05)，見圖11～14，表11、表12。可見，miR-1-3p低表達可部分逆轉FAM225A低表達對CRC細胞SW480、HCT116增殖、遷移、侵襲和凋亡。

1～4:si-NC組、si-FAM225A組、si-FAM225A+anti-miR-NC組、si-FAM225A+anti-miR-1-3p組；下圖同圖11 低表達miR-1-3p和FAM225A后細胞克隆形成

圖12 低表達miR-1-3p和FAM225A后細胞凋亡

圖13 低表達miR-1-3p和FAM225A后細胞遷移和侵襲數

圖14 低表達miR-1-3p和FAM225A后相關蛋白表達量

3 討 論

早發現、早診斷、早治療是有效防治CRC的關鍵，因此尋找CRC特異性腫瘤標志物和治療靶點至關重要〔10，11〕。LncRNA和miRNA均屬于非編碼RNA，可通過多種分子機制參與腫瘤的發生和發展，也參與調控CRC的進展，可作為CRC診斷、治療及預后靶標〔12，13〕。FAM225A是一種致癌LncRNA，研究報道FAM225A在鼻咽癌中上調表達，且與鼻咽癌的不良生存率顯著相關；其高表達促進鼻咽癌細胞增殖、遷移、侵襲、腫瘤生長和轉移；且FAM225A與miR-590-3p和miR-1275結合調節整合素β3(ITGB3)表達促進鼻咽癌腫瘤發生和轉移〔14〕。本實驗結果說明FAM225A低表達抑制CRC細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。CyclinD1是細胞周期關鍵調節蛋白，被認為是一種原癌基因，過表達促進細胞增殖〔15〕。MMP-2、MMP-9屬于MMPs家族，影響細胞的遷移和侵襲，且有研究發現轉移性CRC患者中MMP-2、MMP-9高表達〔16〕。裂解caspase-3是一種抑癌基因，可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡〔17〕。因此，本實驗結果進一步證明了FAM225A低表達可抑制CRC SW480、HCT116細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進凋亡。

研究發現miR-1-3p可參與調控腫瘤細胞的進展，如過表達miR-1-3p可抑制膀胱癌細胞的增殖，侵襲和遷移能力〔18〕。在肝癌患者和口腔鱗狀細胞癌中miR-1-3p表達水平降低，并與患者的預后相關；過表達miR-1-3p可抑制肝癌、口腔鱗狀細胞癌細胞的惡性生物學行為〔19，20〕。本實驗結果說明高表達miR-1-3p可抑制CRC SW480、HCT116細胞的惡性生物學行為。miR-1-3p在CRC、膀胱癌、肝癌和口腔鱗狀細胞癌中可能均作為抑癌因子。還有研究報道分化拮抗非蛋白編碼RNA(DANCE)可通過競爭性結合miR-1-3p激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB，又稱Akt)/核因子(NF)-κB信號通路介導膠質瘤細胞對順鉑的耐藥性〔21〕。綜上，抑制FAM225A表達可能通過調控miR-1-3p抑制CRC細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。