不同提取工藝對金櫻子黃酮體外抗氧化活性的影響1）

陳傳平，彭成，方士英，陳乃東

（1.皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，安徽 六安237000；2.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安237012）

金櫻子（Rosa laevigatae Michcx.），系薔薇科薔薇屬常綠灌木的果實，在我國南方大部分地區(qū)均有分布，其中皖大別山區(qū)資源尤為豐富［1］。作為一種傳統(tǒng)中藥，金櫻子可以治療神經(jīng)衰弱，高血壓，慢性胃炎等多種疾病；在食品加工上還可生產(chǎn)保健飲料［2－4］。

黃酮類化合物廣泛分布于植物界中，是一類重要的天然有機化合物，近年研究表明具有多種生理活性，如抗氧化、抗腫瘤、清除自由基、抗血小板凝集等［5－6］。金櫻子中富含黃酮類化合物，且是其藥理作用的主要成分之一，對金櫻子黃酮（RFs）的提取常用方法有溫水浸提、醇提、丙酮提及酶法等［7－8］，報道中主要圍繞黃酮得率而進行，但對不同工藝所得黃酮活性還沒有作進一步研究。本實驗在采用不同工藝對金櫻子黃酮類化合物提取的基礎(chǔ)上，對每個組份進行體外抗氧化活性測試，并對結(jié)果進行比較，為進一步找到具有最佳生理活性的金櫻子黃酮提供理論依據(jù)，以便更好地開發(fā)這種藥食兩用資源。

1 材料與方法

1.1 材料

金櫻子：產(chǎn)地為皖六安市金寨縣，采摘于2011年10月，自然曬干。

1.2 試劑與儀器

蘆丁（Rutin上海生化試劑一廠）、石油醚、乙醇、硼氫化鈉、水楊酸、FeSO4、AlCl3、NaOH、HCl、FeCl3、鎂粉、NaNO2、Al（NO3）3等，均為分析純。索氏提取器；數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市正基儀器有限公司）；751紫外－可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）；精密電子天平（Precisa公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE－52，上海青蒲滬西儀器廠；冷凍干燥機FD－1，北京博醫(yī)康公司。

1.3 樣品預(yù)處理

金櫻子原料→洗凈，去籽90℃烘干（48h）→粉碎，過40目篩→石油醚回流脫脂（60℃，2h）→揮干溶媒，備用。

1.4 不同提取工藝金櫻子黃酮的制備

1.4.1 金櫻子黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取四份已脫脂的金櫻子粉末5.0g，置錐形瓶中，分別加入水、60%甲醇、60%乙醇、60%丙酮500mL作提取劑，60℃回流提取2.5h，過濾，濾液減壓濃縮后冷凍干燥，得水提金櫻子黃酮（RF1）、甲醇提金櫻子黃酮（RF2）、乙醇提金櫻子黃酮（RF3）及丙酮提金櫻子黃酮（RF4），待檢測活性。

1.4.2 黃酮含量的測定

準(zhǔn)確稱取蘆丁10mg加入80%的乙醇定容至100mL，移取蘆丁溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL加70%乙醇定容至25mL，按文獻［9］測鋁鹽光譜的操作進行，選擇所測得的蘆丁鋁鹽在可見光區(qū)吸光度最大時的波長作為入射波長測吸光度，用最小二乘法繪制工作曲線（見圖1）。同樣操作，測RFs液的吸光度，代入工作曲線求黃酮濃度。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 不同提取工藝的金櫻子黃酮體外抗氧化活性測定

1.5.1 濃度選擇

用1.4.2法跟蹤測定，配制RFs濃度為25、50、100、200、400、800μg／mL6個濃度梯度，平行3份，一組空白作對照。

1.5.2 O2－清除率的測定

按文獻［10］的方法，配制 AP－TEMED體系溶液（見表1），在AP－TEMED體系中產(chǎn)生O2－自由基，O2－與羥胺反應(yīng)，生成 NO2－，NO2－經(jīng)苯磺酸－α萘胺顯色在520nm處有一吸收峰，其顏色深淺與產(chǎn)生的O2

—呈劑量效應(yīng)關(guān)系。25℃時，取A液0.40mL，B液1.60mL（A∶B＝1∶4）混合，反應(yīng)1min，加入不同濃度的AFs液，再加入10.00mmol／L的鹽酸羥胺0.40mL，在25℃下反應(yīng)25min，以不加AFs液為對照樣，用分光光度計測A520值。AFs液對氧自由基的清除率計算公式如下：

清除率＝（C－D）／C×100%

C：對照液的A520值；D：加入不同濃度AFs待測液體系的A520值。

表1 AP－TEMED體系溶液配制表

1.5.3 ·OH清除率的測定

利用Fenton反應(yīng)檢測AFs對羥自由基（·OH）的清除作用［11］。計算公式如下：

·OH清除率＝（A0－AX×AX0）／A0×100%

A0為空白對照液的吸光度，AX為加入AFs液后的吸光度，AX0為不加顯色劑H2O2AFs液本底的吸光度。

1.5.4 POV值的測定（GB／T5009.37－1996油脂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)）

精密稱取PG50mg、AFs粉各50mg，用適量60%乙醇溶解，加入到裝有50g經(jīng)熔化處理豬油的碘量瓶中，在65℃下攪拌30min，使抗氧化劑（AFs）均勻分散在油樣中。塞緊瓶塞，置于65.0℃恒溫箱中保存。每隔24h，將瓶中的油樣攪拌均勻，測定其POV值。以不加AFs的油樣為空白對照。平行3份，取平均值。計算公式如下：

式中：V1為試樣消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，V2為空白試驗消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，C為Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，M為樣品質(zhì)量。

1.5.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，經(jīng)SPSS13.0for windows數(shù)據(jù)包處理，組間差異比較采用t檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取工藝的金櫻子總黃酮得率

從表2可看出，不同提取劑對金櫻子總黃酮得率有一定影響，甲醇提取率最高，為5.49%，乙醇與之相近，水最低，只有3.75%，可能是黃酮類化合物的水溶性差所導(dǎo)致。考慮甲醇有毒，故可舍之而用乙醇提取。

表2 四種方法所提取的金櫻子總黃酮得率

2.2 AFs的體外抗氧化性測試結(jié)果

2.2.1 金櫻子黃酮對O2－及·OH清除率測試結(jié)果，見表3。

表3 金櫻子黃酮對O2－和·OH的清除作用（X－±s，n＝3，%）

由表3可以看出，AFs在25～800μg／mL范圍內(nèi)對O2－和·OH有濃度依耐性清除作用，隨著濃度的提高，清除率有所上升。在對O2－的清除作用中，AF3的活性最強，其線性關(guān)系y＝0.0744x＋2.1801，R2＝0.9954，半 清 除 率 濃 度 EC50為642.7μg／mL。對方程進行t檢驗，t＝29.43＞t0.001，4＝7.173，所以回歸方程在0.001水平上顯著。對·OH的清除作用中，AF1活性最強，而AF3僅次之，差別不是很大，其線性關(guān)系是y＝0.0318x＋3.793，R2＝0.9800，半 清 除 率 濃 度 EC50為1455.1μg／mL。方程t檢驗得t＝14.00＞t0.001，4＝7.173，回歸方程在0.001水平上顯著。

2.2.2 不同劑量的AFs在豬油中的抗氧化活性測試結(jié)果，見圖2。

圖2 金櫻子黃酮在豬油中的抗氧化作用

從圖2中可看出，在豬油中添加AFs，對豬油POV升高可明顯抑制，說明AFs在豬油中有較好的抗氧化活性。但不同工藝提取的AFs，其抗氧化活性有所不同，其中AF3（即60%乙醇提取的金櫻子黃酮）表現(xiàn)最活潑，而AF1（即水提取的金櫻子黃酮）最弱。

綜上所述，采用不同提取工藝所得的金櫻子黃酮的體外抗氧化性有所不同，其中60%乙醇提取的金櫻子黃酮活性最強。大部分黃酮的抗氧化作用的機理與其它酚類抗氧化劑相似，自身作為優(yōu)良的供氫體，向活潑自由基提供氫后，形成的自由基可通過共振雜化與其它自由基結(jié)合成穩(wěn)定的二聚體，從而切斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，發(fā)揮抗氧化作用。因此，分子結(jié)構(gòu)的差異決定了抗氧化活性的不同，不同提取工藝所得的金櫻子黃酮其分子結(jié)構(gòu)可能有一定的差異，本課題組將繼續(xù)作深入研究。

3 結(jié)論

3.1 四種提取劑中，60%甲醇與60%乙醇提取AF得率較高并接近，故可而用60%乙醇進行提取。

3.2 四種提取工藝所得AFs的體外抗氧化活性不同，其中60%乙醇提取的AF對O2－的清除能力及在豬油中的抗氧化活性最強，水提取的AF對·OH清除率最高。

［1］ 余宏，陳傳平.安徽省大別山山區(qū)金櫻子資源開發(fā)利用現(xiàn)狀調(diào)查［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2012，18（12）：124.

［2］ 閔俊，李燕燕，余華.金櫻子的化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2008（2）：16－18.

［3］ 張曙明，顧志平.中藥金櫻子的研究應(yīng)用概況［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1996，8（4）：57.

［4］ 莫開菊，謝筆均.葛仙米多糖的提取分離與純化技術(shù)研究［J］.食品科學(xué)，2002，19（3）：27－29.

［5］ 李榮，李俊.黃酮類化合物藥理活性及其構(gòu)效關(guān)系研究進展［J］.安徽醫(yī)藥，2005，9（7）：481－483.

［6］ Huang，W；Ochiai，H.；Zhang，X.Y，et al.Introducing N－glycans into natural products through a chemoenzymatic approach［J］.Carbohyd Res，2008，343（17）：2903－2913.

［7］ 李尼曼，鐘曉紅，李麗娜，等.金櫻子黃酮類化合物提取工藝研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（3）：79－82.

［8］ 陳乃富，張莉，夏冠軍.金櫻子黃酮類化合物提取條件研究［J］.中國林副特產(chǎn)，2006（4）：1－4.

［9］ 鐘世安，李維，喬蓉.分光光度法測定柚皮中黃酮類化合物 ［J］.光譜實驗室，2007，24（4）：597－601.

［10］ 吳華慧，李雪華.荔枝、龍眼果肉及荔枝、龍眼多糖清除活性氧自由基的研究［J］.食品科學(xué)，2004，25（5）：166－169.

［11］ 夏曉凱，張庭廷，陳傳平.黃精多糖的體外抗氧化作用研究［J］.湖南中醫(yī)雜志，2006，22（4）：90，96.