外源鈣對香菇富集重金屬的抑制作用1）

李海波，魏海龍，胡傳久，付立忠，吳學謙，吳慶其

（1.浙江省林業科學研究院，杭州 310023；2.浙江省醫學科學院，杭州310013）

大型真菌對重金屬生物富集現象的認識始于20世紀70年代蘑菇屬（Agaricus）真菌內鎘（Cd）的高水平積累的發現，隨后人們紛紛發現很多大型真菌都具有較強富集重金屬如汞（Hg）、Cd、鉛（Pb）、砷（As）、銅（Cu）等的能力和作用。與綠色植物相比，食用菌能夠積累更高濃度的鉛Pb、Cd和Hg等有害重金屬［1－4］。重金屬在食用菌的不同生長發育期是必需元素，當處于痕量水平時可促進食用菌的生長，并維持所需重金屬在體內的動態平衡；但是當重金屬含量超過一定濃度時，則對食用菌形成脅迫毒害作用。香菇是著名的食（藥）用大型真菌，其產量位居所有食用菌類的前三位，在我國食用菌出口貿易中占有重要地位。近年來有大量有關香菇等食用菌重金屬含量的分析檢測、背景值測算和富集規律的研究報道。這些研究均表明，香菇對于重金屬元素Pb、Cd、Hg和As具有極強的富集能力，重金屬可積累在香菇的子實體部分，并通過食物鏈進入人體，危害人體健康［5－12］。在自然界中，微量元素并不是單獨存在的，而且在微量元素之間存在著相互制約的現象，影響著生物對它們的吸收利用。對重金屬蓄積植物的研究表明，礦質元素鈣（Ca）可以與重金屬Cd競爭植物根系上吸收位點，從而降低植物對Cd的吸收［13］。添加外源Ca可以增強植物對許多非生物逆境的適應性，減輕逆境對植物所造成的傷害［14］，其機理可能是通過對有害礦質元素的拮抗作用［15］、維持較高的抗氧化保護酶系統活力［16］以及發揮鈣信使系統的功能［17］等。因此，借鑒Ca對植物抗逆境的保護作用，通過外源Ca的添加來緩解重金屬對香菇等栽培食用菌的脅迫毒害作用、抑制其對重金屬的超量富集是值得探索的一條思路，但迄今為止，在食用菌研究領域，無論在基礎研究層面上，還是應用技術層面上，尚缺乏礦質元素（如Ca、Mg、Zn）對重金屬富集影響的研究，缺乏利用外源礦質元素對重金屬富集的阻斷技術研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 香菇菌種

香菇（Lentinual edodes）菌種939，由麗水市食用菌研究開發中心提供。

1.1.2 配方

（1）母種培養基配方：2% 葡萄糖、0.2% 酵母粉、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、瓊脂若干。

（2）含重金屬液體培養基配方：在含3% 豆餅粉、2% 葡萄糖、1% 酵母粉、0.5% 蛋白胨、1% 維生素B1、0.1%KH2PO4和0.05%MgSO4·7H2O的液體培養基基礎上，分別添加Pb 150mg／L、Cd 20mg／L、As 5mg／L、Hg 20mg／L形成4種含重金屬培養基。每種重金屬培養基中分別添加濃度為0.1、0.5、1.5、3.0g／L的Ca2＋形成4個處理，不添加Ca2＋作為對照。

（3）含重金屬栽培基質配方：在含78%木屑、20%麩皮，水適量的栽培基質基礎上，分別添加如表1所示的重金屬量。再在每種含重金屬的栽培基質中分別添加1%、2%、4%、6%的含Ca2＋礦質添加劑形成4個處理，不添加Ca2＋礦質添加劑作為對照。栽培基質裝袋制成15cm×55cm的香菇菌棒。

表1 不同重金屬的添加量及菌棒實測值 mg·kg－1

1.1.3 試劑

4種重金屬 Pb［Pb（CH3COO）2·3H2O］、Cd（CdCl2·2.5H2O）、As（As2O3）、Hg（HgCl2）和礦物質Ca（CaCl2）均購自浙江華東醫藥器化公司。添加在香菇培養基中的重金屬離子和礦物質離子均按照分子量換算成相應的離子含量，按照添加量的濃度配制成標準溶液，其中Pb、Cd、Hg是溶于水中配制而成，As是溶于20%的氫氧化鈉溶液中配制而成，礦物質Ca是溶于水中配制而成。

1.2 方法

1.2.1 液體培養方法：試驗前將香菇菌種轉接至PDA斜面活化，24℃培養5天。在500mL三角瓶中裝200mL母種培養基，于121℃滅菌30min。從活化好的斜面菌種上取5塊0.3cm×0.3cm大小菌種塊接種三角瓶中，置搖床上培養（26℃，轉速200 r／min）3天。之后取10%轉接入含重金屬的液體培養基，置搖床上培養（26℃，轉速200r／min）25天后，紗布過濾，菌絲體蒸餾水沖洗后，3000r／min離心15min，棄上清液后，稱重。每個處理設3個重復，每個重復10個搖瓶。

1.2.2 固體基質培養方法：在香栽培基質添加如表1所示的重金屬和含Ca2＋礦質添加劑，裝袋制成香菇菌棒，滅菌后接種香菇膠囊菌種，接種后的培養溫度為25～26℃，按常規進行菌棒培養管理，采用高棚層架栽培模式進行出菇管理。出菇后收獲子實體檢測重金屬含量。每個處理設3個重復，每個重復25個菌棒。

1.2.3 重金屬含量檢測方法：Hg總量測定（GB／T5009.17－2003）：冷原子吸收光譜法即五氧化二釩消化法檢測；As總量測定（GB／T5009.11－2003）：氫化物原子熒光光度法檢測；Pb總量測定（GB／T5009.12－2003）：石墨爐原子分光光度法進行檢測；Cd總量測定（GB／T5009.15－2003）：石墨爐原子分光光度法進行檢測。

1.2.4 統計學方法：采用SPSS 11.0軟件，對所有數據均以平均均數±標準差（Mean±SD）表示，各處理間的比較采用最小顯著差值法LSD－t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果與分析

2.1 Ca2＋對培養基污染Pb、Cd、As、Hg的香菇菌絲體生物量的影響

Ca2＋對培養基污染Pb、Cd、As、Hg的香菇939菌絲體生物量產生了較大影響（表2）。在含有Pb、Cd、As、Hg的液體培養基中生長的香菇939，在未添加Ca2＋時，其菌絲體生物量分別為0.014、0.245、0.410和0.0820g／100mL，添加 Ca2＋后，其菌絲體生物量呈現增加的趨勢，當Ca2＋添加量達到3g／L時，培養基中含有Pb、Cd、Hg的香菇939的菌絲體生物量達到最大值，分別為0.709、0.85和2.332g／100mL，分別是未添加Ca2＋的50.6、3.5和5.7倍。在含As的培養基中，Ca2＋的添加量為0.1g／L時，香菇939的菌絲體生物量就達到了最大值0.44g／100mL，是未添加Ca2＋的5.4倍，繼續增加Ca2＋的含量，菌絲體生物量呈現下降的趨勢。這表明在4種重金屬的脅迫作用下，香菇的生長均不同程度地受到抑制，而外源添加的Ca2＋可能通過離子拮抗作用降低了香菇子實體對4種重金屬離子的大量吸收，進而減輕重金屬對香菇的毒害作用。同時，在Ca2＋的拮抗效果上，Ca2＋對As富集的拮抗在低添加量（0.1g／L）時已達到最大，而對Pb、Cd、Hg富集的拮抗在高添加量（3.0g／L）時尚未達到最大。

表2 Ca2＋對培養基污染重金屬的香菇939菌絲體生物量的影響 g·100mL－1

2.2 含Ca2＋礦質添加劑對香菇富集重金屬Pb、Cd、As、Hg的影響

由表1可見，即使在香菇固體栽培基質中不添加任何濃度的重金屬元素，但在菌棒中依然可以檢出4種重金屬Pb、Cd、As、Hg的存在，這表明香菇培養料（包括木屑、麩皮等）和產地環境中的土壤、水均含有一定濃度的重金屬元素。在人為添加一定濃度的重金屬元素后，菌棒中的4種重金屬含量顯示出了較大程度的增加，Pb、Cd、As、Hg分別由1.10、0.07、0.19、0.02增至35.06、1.20、6.45、0.89mg／kg干料重。這表明在香菇栽培過程中，外源污染的重金屬元素在栽培菌棒中得到富集，在菌棒中高含量的重金屬元素通過菌絲進一步向子實體遷移，進而導致子實體大量富集重金屬。

我們近年來的研究結果已表明，香菇栽培基質中的重金屬可以通過菌絲體的吸收、富集并進一步遷移到香菇子實體中，栽培者可以從源頭上通過控制培養料中的重金屬限量或阻斷遷移途徑來控制香菇子實體中重金屬含量［18］。在本研究中，我們嘗試通過使用含Ca2＋礦質添加劑來阻斷香菇子實體對4種重金屬的富集。由圖1可見，在不添加含Ca2＋礦質添加劑時，香菇子實體中4種重金屬Pb、Cd、As、Hg的含量分別為1.20、2.70、1.53、1.39mg／kg，隨著含Ca2＋礦質添加劑在香菇培養料中添加濃度從1%、2%、4%到6%的逐步提高，4種重金屬的含量呈不斷下降趨勢，在最高添加濃度為6%時，Pb、Cd、As、Hg的含量分別下降到了0.45、1.43、0.69和0.28mg／kg，分別降低了62.5%、47.0%、54.9%、79.9%。這表明Ca2＋可能通過離子拮抗作用降低了香菇子實體對4種重金屬離子的大量吸收。對南美蟛蜞菊（Wedelia trilobata）毛狀根毒害的生理機理研究表明10～30mM Ca2＋可顯著減少毛狀根對Cd2＋的吸收和吸附，并可調節其抗氧化酶活性，降低其膜脂過氧化水平而解除重金屬Cd對毛狀根生長的抑制或毒害［19］。此外，對金針菇、平菇的富集重金屬研究表明，Cd與鋅（Zn）之間存在互相拮抗作用［19］，Ca2＋、鎂（Mg2＋）、鐵（Fe2＋）對 Hg2＋抑制平菇菌絲生長的毒害有一定的拮抗解毒效果［20］。

圖1 不同濃度含Ca2＋礦質添加劑對香菇富集重金屬的影響

2.3 含Ca2＋礦質添加劑對香菇富集重金屬影響的差異顯著性

表3 含Ca2＋礦質添加劑對香菇富集重金屬影響的差異顯著性

由表3的LSD－t檢驗可見，含Ca2＋礦質添加劑對Pb、Hg、As 3種重金屬富集的抑制作用在不同的濃度水平上均存在極顯著差異；在對Cd富集的抑制作用上，4%和6%的含Ca2＋礦質用量與CK、1%、2%用量差異顯著。這表明在香菇培養料中添加含Ca2＋礦質添加劑對Pb、Hg、Cd、As 4種重金屬富集均有抑制作用，香菇子實體中Pb、Hg、Cd、As含量均會隨著Ca2＋礦質添加量的增加而降低，但Cd只有在Ca2＋礦質添加量達4%和6%時，才明顯降低。這一結果提示在香菇栽培生產中，可以通過在栽培基質配方中添加含Ca2＋礦質添加劑對Pb、Hg、Cd、As 4種重金屬的富集進行阻斷，但針對不同的重金屬的阻斷效果，添加含Ca2＋礦質的用量有所不同。

3 結論

3.1 香菇液體培養基中添加一定濃度的Ca2＋可以顯著減輕4種重金屬Pb、Cd、As、Hg對香菇生長的脅迫毒害作用，增加重金屬脅迫下香菇菌絲體的生物量；

3.2 香菇栽培基質中添加一定量的含Ca2＋礦質添加劑可顯著抑制子實體對4種重金屬離子的大量富集；

3.3 本研究結果提示在香菇栽培生產中，可以通過在栽培基質配方中添加一定量的含Ca2＋礦質添加劑對4種重金屬進行阻斷。

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