拮抗菌RY3抗菌粗蛋白理化性質(zhì)及其對柑橘綠霉病菌的抑菌活性

陳召亮張 輝，2張娜娜，3喬勇進(jìn)

CHEN Zhao－liang1ZHANG Hui1，2ZHANG Na－na1，3QIAO Yong－jin1

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海 201403；2.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；3.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

由柑桔綠霉病菌PenicilliumdigitatumSacc.引起的柑橘綠霉病是導(dǎo)致柑橘采后腐爛損失的重要病害，腐爛率一般為10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)60%以上，嚴(yán)重制約著柑桔采后的貯運(yùn)及銷售［1］。目前，化學(xué)殺菌劑處理是控制該病的主要方法［2，3］。但長期使用化學(xué)殺菌劑易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，且造成農(nóng)藥殘留，環(huán)境污染、危害人類健康等［4，5］。采用微生物及其代謝產(chǎn)物控制果蔬采后病害及進(jìn)行生物保鮮已成為今年研究的熱點(diǎn)［6］。抗菌蛋白或抗菌多肽是許多生防微生物都能分泌的一類活性物質(zhì)，具有抗菌廣譜性和高效性、對人畜無毒、對環(huán)境無污染的優(yōu)良特性，且病菌對其不易產(chǎn)生抗性［7］。隨著人們食品安全意識和環(huán)保意識的增強(qiáng)，采用以抗菌蛋白為代表的生防制劑防治果蔬采后病害成為當(dāng)今果蔬采后防腐保鮮的研究熱點(diǎn)。

解淀粉芽孢桿菌RY3是從冬棗果園根際土壤分離篩選獲得的一株高效拮抗細(xì)菌，前期預(yù)試驗(yàn)表明其發(fā)酵液對柑橘青綠霉病菌、桃褐腐病菌、冬棗漿胞病菌等多種水果采后致病真菌具有較高的抑菌活性。為明確該拮抗菌的抗菌物質(zhì)的特性及對果蔬采后致病真菌的抗菌活性，本研究對其抗菌粗蛋白的理化性質(zhì)及其對柑橘采后綠霉病菌的抗菌活性進(jìn)行了研究，以期為該拮抗菌在果蔬采后防腐保鮮中的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

解淀粉芽孢桿菌RY3：由本實(shí)驗(yàn)室從冬棗果園根際土壤中分離獲得；

柑橘綠霉病菌（Penicilliumdigitatum）：由本實(shí)驗(yàn)室從綠霉病發(fā)病柑橘果實(shí)上分離獲得；

PDA培養(yǎng)基：200g馬鈴薯，20g葡萄糖，17g瓊脂粉，1 000mL蒸餾水；

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）［8］：牛肉膏5.0g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂18g、蒸餾水1 000mL、pH調(diào)至7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉10g／L、黃豆餅粉5g／L、碳酸氫銨10g／L、碳酸鈣5g／L，pH 調(diào)至7.0。

1.2 試驗(yàn)儀器

高速冷凍離心機(jī)：Allegra X－22R型，美國Beckman coulter公司；

攝像顯微鏡：Axioskop 2plus型，德國卡爾蔡司公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX－250B－Z型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：BUCHI B－490型，瑞士Buchi公司；

空氣浴搖床：HWY211型，上海智誠分析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抗菌粗蛋白的制備 將活化好的RY3菌種按2%接入裝有125mL培養(yǎng)液的250mL的三角瓶中，在34℃、180r／min搖床上振蕩培養(yǎng)30h后，取發(fā)酵液，10 000r／min離心20min，收集上清液。將上清液倒入無菌三角瓶中，加入 HCl（7mol／L）調(diào)節(jié)pH＝2，過夜沉淀。再分裝于50mL的離心管，每管30mL，于4℃、10 000r／min離心25min，去上清液，向每管沉淀中加入1.5mL的甲醇（pH＝7），混合均勻，萃取8h。然后在4℃下10 000r／min離心20min，取上清液。同樣方法萃取兩次，合并上清液。將合并后的萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，每升細(xì)菌發(fā)酵液得到10mL抗菌粗蛋白。

1.3.2 抗菌粗蛋白理化性質(zhì)研究

（1）熱穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白分別于50℃／60min，80℃／30min，80℃／60min，100℃／30min，100℃／60min的條件下進(jìn)行水浴處理，采用懸滴法［9］測定其對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制活性，每個(gè)處理重復(fù)3次，以未經(jīng)熱處理的抗菌粗蛋白為對照。

（2）對pH的穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白用1mol／L的鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，并于4℃貯存過夜，再將各pH值用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)回中性，測定其對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制活性，每個(gè)處理重復(fù)3次，測定方法同上，以未經(jīng)處理的抗菌粗蛋白做對照。

（3）對紫外線的穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白在20W紫外燈下距離10cm 處，照射2，4，6，8，10，12，14，24h，測定其對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制活性，每個(gè)處理重復(fù)3次，測定方法同上，以未經(jīng)處理的抗菌粗蛋白做對照，設(shè)抑菌率為100%。

（4）對蛋白酶的穩(wěn)定性：將抗菌粗蛋白分別用胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K在37℃處理60min，酶反應(yīng)濃度為1mg／mL，測定其對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制活性，每個(gè)處理重復(fù)3次，測定方法同上，不加蛋白酶處理為對照。

1.3.3 抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌的抑菌活性

（1）抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)活性的影響：首先制備不同稀釋倍數(shù)的抗菌粗蛋白溶液和濃度為106個(gè)／mL的柑橘綠霉病菌分生孢子懸浮液（加入適量2%的蔗糖溶液），分別取抗菌粗蛋白、分生孢子懸浮液各1mL于編號試管中，充分混勻后，使抗菌粗蛋白稀釋倍數(shù)分別為10，20，50，100，200，400倍，以無菌水作對照，然后將藥液、孢子混合液滴在雙凹片上，放在帶有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)懸滴，每處理重復(fù)3次，25℃靜置培養(yǎng)24h，光學(xué)顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)孢子的總數(shù)和萌發(fā)的孢子數(shù)，按式（1）計(jì)算孢子萌發(fā)率，每重復(fù)調(diào)查100個(gè)孢子，以芽管長度大于分生孢子長直徑即視為萌發(fā)。

（2）抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)形態(tài)及菌絲形態(tài)的影響：采用瓊膠表面孢子萌發(fā)法，抗菌粗蛋白和PDA培養(yǎng)基按1∶9的比例制備平板，制備稀釋倍數(shù)為50倍的帶毒平板，采用涂布法接種綠霉病菌懸浮液（1.0×106個(gè)／mL），用攝像顯微鏡對孢子萌發(fā)、菌絲形態(tài)進(jìn)行拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌粗蛋白熱穩(wěn)定性

由表1可知，解淀粉芽孢桿菌RY3的抗菌粗蛋白經(jīng)50℃處理60min、80℃處理30min和60min后其抑菌活性與對照相比幾乎不變。經(jīng)100℃處理30min和60min后抑菌活性略有下降。由此可見抗菌蛋白對熱不敏感。

2.2 抗菌粗蛋白對pH的穩(wěn)定性

由圖1可知，酸性條件對抗菌粗蛋白的抑菌活性幾乎無影響，當(dāng)pH值為2至6時(shí)，RY3的抗菌粗蛋白的抑菌活性幾乎無變化，均在原有活性的90%以上；堿性條件下抗菌蛋白活性下降明顯，pH值為8時(shí)抑菌活性稍有下降；pH值為10和12時(shí)，抗菌粗蛋白的抑菌活性下降幅度較大，與pH值為6時(shí)差異極顯著（P＜0.01）；當(dāng)pH為14時(shí)，粗蛋白幾乎失去活性。說明RY3的抗菌粗蛋白耐酸但不耐堿，pH為14時(shí)抗菌物質(zhì)粗提物基本失去活性。

表1 不同溫度處理對抗菌粗蛋白抑菌活性的影響Table1 Effect of different temperature on inhibitory rate of antifungal crude protein

圖1 pH值對抗菌粗蛋白抑菌活性的影響Figure1 Effect of different pH on inhibitory activity of antifungal crude protein

2.3 抗菌粗蛋白對紫外線的穩(wěn)定性

由表2可知，紫外線照射6h對抗菌粗蛋白的活性基本無影響，抑菌活性均在原有活性的90%以上，隨著紫外光照射時(shí)間的繼續(xù)延長，抗菌蛋白的抑菌活性開始緩慢降低，紫外光照射12h時(shí)抑菌活性為原有活性的71.94%。說明抗菌粗蛋白耐紫外線。

表2 紫外照射時(shí)間對抗菌粗蛋白抑菌活性的影響Table2 Effect of different time of ultraviolet radiation on inhibitory rate of antifungal crude protein

2.4 抗菌粗蛋白對蛋白酶的穩(wěn)定性

由表3可知，該抗菌粗蛋白經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶處理后，活性幾乎不變；而蛋白酶K處理使其活性降低，但仍能保持原有活性的82.20%，說明抗菌粗蛋白對胃蛋白酶、胰蛋白酶不敏感，對蛋白酶K有一定的耐受性。

表3 不同蛋白酶對抗菌粗蛋白抑菌活性的影響Table3 Effect of different proteinases on inhibitory rate of antifungal crude protein

2.5 抗菌蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)的影響

由圖2可知，柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)活性隨抗菌粗蛋白濃度的增加而降低，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)，高濃度的抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)具有顯著的抑制活性，10，20倍抗菌蛋白稀釋液處理，孢子萌發(fā)率僅為2.86%和10.98%，說明該抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子具有明顯的抑制萌發(fā)活性。

圖2 抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌孢子萌發(fā)活性的影響Figure2 Effect of antifungal crude protein on germination activity of P.digitatum

2.6 抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)形態(tài)和菌絲形態(tài)的影響

抗菌粗蛋白可明顯影響孢子萌發(fā)形態(tài)和菌體形態(tài)，導(dǎo)致芽管和菌體的不正常生長。正常柑橘綠霉病菌孢子萌發(fā)的芽管及菌絲細(xì)長平滑（圖3（a）和圖3（c）），經(jīng)抗菌粗蛋白處理后的孢子芽管膨大變短變粗（圖3（b）和圖3（d））。菌體變粗，發(fā)生菌體細(xì)胞質(zhì)凝集現(xiàn)象（圖3（e））和菌絲消融現(xiàn)象（圖3（f））。

3 討論

解淀粉芽孢桿菌是一類具有廣譜抑菌活性的拮抗細(xì)菌，其主要通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)包括抗菌蛋白和脂肽類抗生素來發(fā)揮抗菌活性［10，11］。在抗菌蛋白研究方面，目前中國報(bào)道的耐熱抗菌蛋白較多［12，13］，但耐酸的抗菌蛋白報(bào)道相對較少［14］。本研究表明RY3產(chǎn)生的抗菌蛋白對熱及酸穩(wěn)定，耐紫外線，對胃蛋白酶、胰蛋白酶不敏感，對蛋白酶K具有一定的耐受性，這些性質(zhì)說明該抗菌蛋白可適應(yīng)特殊復(fù)雜的環(huán)境條件，具有良好的應(yīng)用前景。

本研究中發(fā)現(xiàn)該抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌分生孢子萌發(fā)具有明顯的抑制活性，且可導(dǎo)致芽管腫大變短及菌體細(xì)胞質(zhì)凝集、消融等畸形現(xiàn)象，這與孟利強(qiáng)等［15］和翟如環(huán)等［16］的研究結(jié)果一致。分生孢子是病原菌侵染的重要器官，柑橘綠霉病菌分生孢子活性萌發(fā)受到明顯抑制，芽管及菌體畸形等可使其致病侵染力顯著降低，從而可降低柑橘采后綠霉病的發(fā)生及有效減少采后損失。

圖3 抗菌粗蛋白對柑橘綠霉病菌孢子萌發(fā)形態(tài)和菌絲形態(tài)的影響（10×40）Figure3 Effect of antifungal crude protein on spore germination and mycelial morphology of P.digitatum （10×40）

在抗菌蛋白提取方法的篩選過程中，曾采用了硫酸銨沉淀法，但是獲得的抗菌粗蛋白抗菌活性較低，而采用酸沉淀法獲得的抗菌粗蛋白具有較高的抗菌活性，說明該抗菌蛋白為小分子量蛋白。關(guān)于該抗菌蛋白的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定等工作有待于進(jìn)一步研究。

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