枸杞多糖的化學分析與降血糖作用研究進展

唐華麗孫桂菊陳 忱

TANG Hua－li1，2SUN Gui－ju2CHEN Chen2

（1.重慶三峽學院生命科學與工程學院，重慶 萬州 404000；2.東南大學公共衛(wèi)生學院，江蘇 南京 210009）

糖尿病是嚴重影響人類健康的非傳染性疾病之一。據世界衛(wèi)生組織（WHO）估算［1］，目前全球約有1.8億糖尿病患者，其中中國為3 000萬人。而到2030年糖尿病患者的數量將會成倍的增加，中國的糖尿病患者總數將接近1億人，是臨床亟待解決的問題之一。研究［2］證明，長期使用常見的臨床降糖藥，效果不佳，且有較嚴重的副作用，因此世界各國醫(yī)務工作者和研究人員紛紛致力于從天然藥物中篩選和研究降糖藥物。

枸杞子為中國國家公布的藥食同源品種之一，具有獨特的營養(yǎng)和藥用價值［3，4］。其中枸杞多糖 （Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP）作為枸杞發(fā)揮功效的重要活性成分而成為近年來一個研究的熱點。枸杞多糖能夠降低動物及Ⅱ型糖尿病患者空腹和餐后血糖的作用已被證實，但是關于枸杞多糖是如何進入體內，代謝生成何種物質，代謝組分如何發(fā)揮功效作用等問題尚不清楚。文章就近年來國內外在枸杞多糖化學分析和降血糖作用方面的研究進行綜述，旨在為枸杞多糖的吸收、代謝以及降血糖機制等研究提供參考。

1 枸杞多糖的化學分析

1.1 枸杞多糖的純度鑒定

枸杞多糖的生物學活性與其相對分子質量有很大關系，因此在對枸杞多糖生理功能及其作用機制的深入研究中，相對分子質量是一個重要指標。要測定枸杞多糖的相對分子質量，首先要求鑒定其純度。多糖的純度標準不能用一般化合物的純度標準來衡量，因為即便是多糖純品，其微觀結構也是不均一的，它實際上是一定相對分子質量范圍內的多糖的均一組分，它的純度只能代表相似鏈長的多糖分子的平均分布。國內外對枸杞多糖純度鑒定的方法有比旋度法、層析法、超離心法、電泳法、色譜法、示差折射法、紫外檢測法等［5］。在實際應用中，一般至少需要兩種方法同時對樣品進行純度驗證。王建華［6］對純化后的枸杞多糖亞組分同時采用Sephadex G－200和SDS－PAGE進行純度驗證，結果均表明枸杞多糖各亞組分分子量分布均一。張民等［7］同時采用瓊脂糖凝膠電泳法及高效液相色譜法（HPLC）對經DEAE纖維素和Sephadex G－75色譜柱純化后的枸杞多糖組分進行純度驗證，結果均表明LBP－4a和LBP－5b都是均一的多糖組分。朱彩平等［8］采用瓊脂糖凝膠電泳和紙色譜的方法驗證經Sephadex G－75純化后收集的多糖組分為單一組分。近年來，高效凝膠滲透色譜（HPGPC）結合示差檢測器檢測的方法［9－13］。由于其省時、準確度高等優(yōu)點而被廣泛應用于多糖的純度測定中，多糖組分經凝膠色譜得到一對稱峰，通過面積歸一化法計算不同相對分子質量多糖的組成。

1.2 枸杞多糖含量的測定

目前枸杞多糖含量測定最常用的方法是苯酚—硫酸法［14－17］和蒽酮—硫酸法［18，19］，其原理是多糖在強酸作用下首先水解為單糖，然后迅速脫水生成糠醛或糠醛衍生物，糠醛物質與酚類或胺類化合物縮合，生成有特殊顏色的物質，利用有色物質在特定波長下的吸收強度來計算枸杞多糖的含量。但同時這兩種方法在測定枸杞多糖含量方面還存在爭議，其一是因為多糖本身并不是由某一特定單糖組分構成，且枸杞多糖為一種蛋白多糖，以葡萄糖為標準物參照不合理；其次枸杞多糖的純化很難完全排除單糖等雜質組分的干擾。此外，也有人［20－23］將比旋度法、示差折射法、紫外檢測和硫酸—咔唑法等應用于多糖的成分檢測。

1.3 枸杞多糖相對分子質量的測定

多糖的生理活性通常與其相對分子質量（Mr）有關，因此測定枸杞多糖的Mr是深入研究其構效關系及作用機制的重要工作。多糖的Mr只能代表相似鏈長的平均分布，有數均相對分子質量（Mn）、重均相對分子質量（Mw）和粘均相對分子質量（Mv）3種表示方法，文獻資料通常使用Mw表示多糖的Mr。過去用于測定多糖Mr的方法主要有：超速離心沉降法、滲透壓法、蒸汽壓法、端基法、光散射法、黏度法、凝固點下降法等［5］，可根據待測多糖的分子量范圍選擇測定。目前常用于枸杞多糖Mr測定的方法主要有：凝膠滲透色譜 法［9，24，25］和高效 液 相 色 譜 法［7，13，26］，這 兩 種 方 法 均 要 以已知Mr的標準系列右旋糖酐（dextran）作對照來測定枸杞多糖的Mr。為了避免標曲制作時試驗步驟繁瑣以及試驗誤差，周鵬等［26］采用高效液相色譜與質譜聯用（HPLCMS）的方法對茶多糖蛋白進行分子量測定，王戰(zhàn)勇等［9］采用凝膠滲透色譜和激光光散射聯用儀（GPC－LLS）測定枸杞多糖的Mr，既不需使用多糖標準品又取得了理想的試驗效果。

1.4 枸杞多糖的分析方法及結構描述

1.4.1 枸杞多糖結構分析方法 同樣是生物大分子，多糖的結構遠比蛋白質和核酸復雜，沿用蛋白質結構的分類方法將多糖分為一、二、三、四級結構［27］，其中一級結構為初級結構，包括糖基的組成、糖基排列順序、相鄰糖基的連接方式、異頭碳構型以及糖鏈有無分支、取代位置、官能團類型和含量等。二、三、四級結構為高級結構，是指多糖鏈在以氫鍵和非共價鍵為主的作用下連接而成的空間構象。糖鏈結構的微觀不均一性，使糖鏈的一級結構測定工作更加復雜化，所以目前對枸杞多糖結構的研究多限于其一級結構的分析，主要有化學分析法、儀器分析法、生物學方法以及它們之間聯用的方法，主要結構分析方法見表1。

表1 多糖結構分析方法Table1 The structure analysis method of polysaccharide

1.4.2 枸杞多糖的結構描述 研究枸杞多糖的結構對其發(fā)揮生理功能的作用機制的深入研究，以及更好的利用和開發(fā)枸杞多糖具有重要意義。由于組成枸杞多糖的單糖種類和數目等的不同，其結構非常復雜，目前，國內外對枸杞多糖的結構研究主要集中在其分子量測定、單糖組成及比例、糖環(huán)形式（吡喃環(huán)或呋喃環(huán)）、單糖殘基類型及糖苷鍵連接位點、糖苷取代的異頭異構形式（α－或β－）等初級結構的表達上。趙春久等［36］采用DEAE柱層析法從枸杞多糖中分離得到4個水溶性多糖均一體，除LBPC4的分子量1.0×104，為α－（1→4）（1→6）連接的葡聚糖肽外，LBPC3、LBPC2、LBPC1分別為分子量6.6×104、1.2×104、0.8×104，β－（1→4）（1→6）連接的雜多醣肽。田庚元等［37］早期研究從枸杞子中分離純化得到一種糖蛋白LbGP，經電泳法測定分子量為88kD，該糖蛋白含量為70%，蛋白質含量30%，檢測出16種氨基酸，單糖組成為Arb∶Gal∶Glu＝25∶10∶1，為Glycan－O－Ser鏈接的糖蛋白。郭琦等［38］將純化得到的枸杞多糖組分LBP3－I進行結構和組成分析，紅外光譜表明LBP3－I具有明顯的糖類物質特征吸收峰且含有吡喃環(huán)，掃描電鏡觀察得知LBP3－I主要呈鏈狀伴隨著高度分支結構，且糖鏈間多相互纏繞聚集成環(huán)狀，氣相色譜分析得出其單糖組成分別為鼠李糖基、阿拉伯糖基、木糖基、甘露糖基、葡萄糖基和半乳糖基，且摩爾比率為2.07∶2.38∶3.11∶1.00∶1.12∶2.86，是一種含有結合蛋白的多糖復合物，和田庚元的研究結論相符。Zou等［39］將經DEAE離子交換純化得到的LBP－1進行 HPLC和GC分析，得出LBP－1由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和半乳糖醛酸殘基組成，摩爾比為1.00∶7.85∶0.37∶0.65∶3.01∶8.16，對 LBP－1進行 FT－IR、GCMS、1H－NMR和13C－NMR分析，研究結果表明：各單糖的連接順序依次為（1→5）－α－D－阿拉伯糖－（1→4）－α－D－半乳糖醛酸，通過－（3→6）－連接－（1）－甘露糖分支，鏈終端連接－（1）－甘露糖。目前對枸杞多糖的結構鑒定與描述均建立在：對枸杞多糖進行分離純化得到各種分子量均一的多糖組分，然后選取相對含量較多的組分按表1的方法進行分析，按照單糖的組成和糖苷鍵連接順序對組分多糖進行結構描述。隨著分析分離技術的發(fā)展，糖鏈結構分析工作進展迅速，趨向于用少量樣品（幾十微克到幾毫克）在較短時間內（幾星期內）就能得到糖鏈結構的大部分或幾乎全部信息。相比之下，目前對化學和儀器分析方面的技術方法研究較多，生物學方面的方法研究還比較薄弱。

2 枸杞多糖的降血糖作用

大量研究表明枸杞及其多糖具有降低血糖功能，可能是通過改善胰島細胞形態(tài)功能、修復受損胰島細胞和促進胰島細胞再生，從而達到降低血糖水平的作用。Zou等［39］研究了枸杞多糖LBP－1對大鼠胰島細胞RINm5F和人體肝細胞HepG2的體外降血糖試驗，結果表明：LBP－1具有保護胰島細胞免受氧化損傷、顯著提高細胞存活率以及減輕HepG2的胰島素抵抗作用，對開發(fā)降血糖功能食品和藥物具有重要參考價值。趙蕊等［40，41］分別給予Ⅱ型糖尿病小鼠枸杞多糖高（40mg／kg·BW）、低（20mg／kg·BW）2個劑量水平，考查枸杞多糖對Ⅱ型糖尿病小鼠胰島細胞形態(tài)和功能的影響，給藥中期和后期高、低劑量組血糖濃度與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05），并呈現出一定劑量－效應關系，圖像分析結果表明枸杞多糖可以改善Ⅱ型糖尿病小鼠胰島細胞形態(tài)和功能并促進胰島素的分泌，有良好的降血糖作用。王玲等［42］對四氧嘧啶誘導制備的糖尿病小鼠模型預防性灌胃LBP－D，觀察枸杞多糖LBP－D對帶病小鼠和正常小鼠的血糖水平，結果發(fā)現：在注射四氧嘧啶前4，1h，用LBP－D灌胃給藥可使小鼠血糖濃度從對照組的21.3mmol／L降至注射四氧嘧啶后72h的10.2mmol／L，表明LBP－D有明顯預防血糖升高作用。羅瓊等［43］研究表明：經過提純的枸杞多糖組分LBP－X對四氧化嘧啶糖尿病兔的降血糖效果優(yōu)于粗枸杞多糖，更優(yōu)于枸杞原汁，降糖效率達100%。孫桂菊等［44］研究了枸杞多糖和茶葉多糖（TPS）混合物對Ⅱ型糖尿病大鼠的控制效果，按照高（0.6g／kg·BW）、低（0.3g／kg·BW）2個劑量水平灌胃大鼠，對給藥后高、低劑量組與正常組血糖值進行比較，結果表明：枸杞多糖、TPS混合物具有增加胰島素敏感性和肝糖原儲備，降低血糖水平的作用，對正常動物血糖水平和糖耐量未見影響；該研究組［45］還研究了枸杞多糖對Ⅱ型糖尿病大鼠血清糖基化終產物－肽（AGEs－P）、糖基化血紅蛋白（HbAlc）等指標的影響，結果表明：枸杞多糖能降低Ⅱ型糖尿病大鼠血漿HbAlc、血清AGEs－P及腎臟IL－8的含量，從而起到預防糖尿病的作用。劉磊等［46］應用枸杞多糖灌胃以四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠，探討了枸杞多糖對糖尿病小鼠的降糖作用和對胰島B細胞的保護作用，結果發(fā)現4周后血清胰島素（Ins）水平較治療前顯著上升，說明枸杞多糖確實改善了B細胞功能從而促進了Ins的分泌。

枸杞多糖還可能通過提高機體SOD等抗氧化劑的活力，降低機體MDA的含量，增強機體抗氧化能力及清除氧化產物的能力，減輕或阻止自由基對胰島β－細胞的損傷、促進胰島β－細胞的修復與再生來實現其降血糖作用［47］。汪建紅等［48］通過給試驗小鼠灌胃高（80mg／kg·BW）、中（50mg／kg·BW）、低（20mg／kg·BW）劑量的黑果枸杞果實多糖研究其降血糖功效及其機制，21d后測定試驗小鼠血清與肝臟的超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和肝糖原水平等指標。結果發(fā)現：黑果枸杞果實多糖對降低糖尿病小鼠血糖含量，增強血清和肝臟SOD活性，降低血清和肝臟MDA含量和促進葡萄糖轉變?yōu)楦翁窃矫婢哂酗@著的效果。陳曉琴等［49］比較了枸杞多糖與抗糖藥物鹽酸二甲雙胍的降血糖作用及抗氧化能力，研究發(fā)現：和鹽酸二甲雙胍相比，枸杞多糖抗氧化能力較強而降血糖作用稍弱。低劑量組小鼠的血清SOD活力有顯著提高（P＜0.05），高劑量組血清MDA則極顯著降低（P＜0.01）。

此外，李朝暉等的細胞試驗［50］表明，枸杞多糖具有較好的體外降血糖作用。Luo等［51］比較了枸杞果實浸出液、粗枸杞多糖和經純化的枸杞多糖組分LBP－X對血糖的調節(jié)作用，試驗取等量3種物質灌胃制備好的糖尿病兔子模型，連續(xù)灌胃10d后測定血糖濃度，結果顯示枸杞浸出液、粗枸杞多糖和LBP－X均呈現良好的降血糖效果，其中LBP－X的降血糖作用比枸杞浸出液和粗枸杞多糖更為顯著。

3 展望

枸杞子中的多糖成分具有許多重要生理功能且無毒副作用，因此在臨床應用和功能食品開發(fā)方面具有廣闊的應用前景，備受國內外研究者的青睞，但是由于枸杞多糖結構復雜、純化后各組分樣品量小、分析成本較高等難點限制了對其更深入的研究。現有枸杞多糖的研究成果主要集中在提取、分離純化條件的優(yōu)化、初級結構的表征分析以及發(fā)揮藥效的推測方面。當前對枸杞多糖的研究需從以下幾個方面展開：① 進一步探索并建立系統的綠色環(huán)保、低廉高效的提取純化方法；② 強化枸杞多糖低級結構的表征分析，建立系統可靠的研究手段和表達方法；探索枸杞多糖高級結構的表征和描述，進而研究枸杞多糖結構、溶液行為與活性、功效之間的關系；③ 研究枸杞多糖發(fā)揮生理功效的作用機理，利用動物試驗探索枸杞多糖在體內的降解途徑以及以何種形式、在何部位發(fā)揮其功能作用；④ 加快開發(fā)以枸杞多糖為主要成分的藥品和功能性食品。

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