長沙青皮竹多糖脫蛋白質方法研究

殷 凱 李湘洲 張 勝 王乙庚

YIN KaiLI Xiang－zhouZHANG ShengWANG Yi－geng

（中南林業科技大學材料科學與工程學院，湖南 長沙 410004）

長沙青皮竹 （Bambusatextilisvar.persistens.B.M.Yang）為湖南省優良觀賞竹種［1］，原產地為湖南長沙。竹葉中含有多種對人體有益的活性物質，如黃酮、多糖、氨基酸和微量元素［2－4］。竹葉黃酮的生物活性和提取分離已經有眾多學者進行了研究報道［5－7］，竹葉多糖由于有增強機體免疫及抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化、降血糖和保護肝臟等作用，近年來也受到越來越多的關注。

研究多糖的生理活性，首先要獲得純度較高并具有天然活性的多糖［8］。然而，提取的多糖中通常會含有蛋白質，影響多糖的純度，并使其藥理研究出現較大偏差［9］。在多糖的結構鑒定、活性成分等研究環節往往需要較大量的粗多糖脫除蛋白質操作，粗多糖中脫除蛋白質的方法主要有Sevag試劑法［10］、三氯乙酸法［11］、生物酶法［12］、大孔樹脂法［13］以及聚酰胺吸附法［14］等，其中最常用的是Sevag試劑法和三氯乙酸法。生物酶法多采用蛋白質酶降解多糖中的蛋白質，但酶自身亦是蛋白質，可能在脫除蛋白質的同時又混入新的雜質。方積年等［15］反對用大孔樹脂，認為其適合分離小分子物質，如果分離純化多糖易使多糖活性降低。

聚酰胺是由酰胺聚合而成的一類高分子物質，它對酚類、醌類及黃酮類等富含酚羥基的化合物具有較強的吸附性能［16－18］，聚酰胺理化性質穩定，吸附選擇性獨特，使用周期長，操作方便，不產生二次污染性質，是一種友好型的分離方法。但總體而言，該方法應用在多糖純化方面的報道還較少。在脫除多糖中游離蛋白質方面，孟利等［14］曾用聚酰胺吸附法去除西藏靈菇胞外多糖發酵液中的蛋白質，脫除率為81.59%，總糖回收率達到87.75%；張民［19］采用聚酰胺吸附法去除枸杞多糖中的蛋白質，蛋白質的含量下降到4.7%，枸杞多糖的回收率為98.7%。但是聚酰胺吸附法應用于竹葉多糖的純化，尚未見公開報道。

本試驗以長沙青皮竹為研究對象，分別采用聚酰胺吸附法、三氯乙酸法、Sevag試劑法去除長沙青皮竹葉多糖中的蛋白質，以脫蛋白質過程中多糖損失率和蛋白質去除率作為衡量脫蛋白質效果的考察指標，為竹葉多糖的分離純化尋求適宜的蛋白質脫除方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

長沙青皮竹竹葉：2012年10月采集于中南林業科技大學竹園，經該校林學院陳建華教授鑒定為長沙青皮竹（Bambusatextilisvar.persistens.B.M.Yang）。竹葉自然風干后，用萬能粉碎機粉碎，過20目篩，經乙醇回流脫脂、熱水提取、醇沉離心、冷凍干燥即得青皮竹竹葉多糖。準確稱取適量竹葉多糖，用去離子水溶解，過濾除去不溶物，配制成5.0mg／mL多糖溶液備用。

1.1.2 儀器

冷凍干燥機：LGJ－10型，北京松源華興科技發展有限公司；

臺式高速離心機：TG16－WS型，長沙平凡儀器儀表有限公司；

可見分光光度計：721N型，上海精密科學儀器有限公司。

1.1.3 主要試劑

聚酰胺：柱層析用80～100目，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠；

考馬斯亮藍G－250：上海西塘生物科技有限公司；

其它試劑：均為市售分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 Sevag試劑法脫蛋白質 取3支試管，分別加入4mL粗多糖溶液，各滴加1mL Sevag試劑（氯仿∶正丁醇＝4∶1），恒 溫 （35 ℃）振 蕩 30min，4 000r／min 離 心15min，取上清液，再滴加1mL Sevag試劑，振蕩離心，重復操作4次，直至有機相與水相界面處不再出現白色膠狀物，測定上清液中蛋白質及多糖的含量。

1.2.2 三氯乙酸法脫蛋白質 取3支試管，分別加入4mL多糖溶液，各滴加4mL 3%三氯乙酸溶液，搖勻，于4℃冰箱中靜置12h，4 000r／min離心20min，取上清液，測定其蛋白質及多糖的含量。

1.2.3 聚酰胺吸附法脫蛋白質 聚酰胺去除雜質后，準確稱取10.0g，上柱壓實平整。將25mL多糖溶液經過恒流泵注入柱床，靜置12h后，用5倍體積的去離子水洗脫，收集洗脫液，旋轉蒸發濃縮至25mL，分別測定濃縮液中的蛋白質與多糖含量。同時考察5.0，7.5，12.5，15.0g聚酰胺對多糖中蛋白質的清除情況，平行試驗3次。

1.3 測定方法

1.3.1 多糖含量的測定 采用苯酚－硫酸法［20］。在體積一致的前提下，多糖損失率計算公式見式（1）。

式中：

R1——多糖損失率，%；

c0—— 脫蛋白質前溶液中多糖含量，mg／mL；

c1—— 脫蛋白質后溶液中多糖含量，mg／mL。

1.3.2 蛋白質含量的測定 采用考馬斯亮藍法［21］。在體積一致的前提下，蛋白質脫除率計算公式見式（2）。

式中：

R2——蛋白質脫除率，%；

d0—— 脫蛋白質前溶液中蛋白質含量，mg／mL；

d1—— 脫蛋白質后溶液中蛋白質含量，mg／mL。

2 結果與分析

2.1 聚酰胺用量對脫蛋白質效果的影響

聚酰胺不同用量脫蛋白質效果的比較見表1。由表1可知：聚酰胺的用量對于脫除竹葉粗多糖中蛋白質的效果影響顯著。隨著聚酰胺用量的增加，洗脫液中所含的蛋白質不斷降低，表明聚酰胺吸附蛋白質的量呈增大趨勢；但在吸附蛋白質的過程中，多糖損失率也呈增大趨勢。當聚酰胺用量超過10.0g以后，蛋白質脫除率的效果趨于平衡，而多糖損失率增加明顯。因此聚酰胺用量控制在10.0g為宜。由此也可推導出0.5mg／mL的多糖液與聚酰胺用量的最佳比例是25mL∶10.0g，即液固比為2.5∶1（V∶m）。

表1 不同質量聚酰胺脫蛋白質效果的比較Table1 Comparision about different quality of polyamide（n＝3）

2.2 3種方法脫除蛋白質效果的比較

以2.1獲得的最佳聚酰胺用量，對青皮竹粗多糖進行蛋白質脫除，3種脫蛋白質方法的效果比較見表2。由表2可知：從多糖損失率的角度而言，3種方法中三氯乙酸法處理后多糖損失率最大，Sevag試劑法多糖損失率最小。而從蛋白質脫除效果考察，則三者蛋白質脫除率依次為聚酰胺吸附法＞三氯乙酸法＞Sevag試劑法。

表2 3種脫蛋白質方法的效果比較Table2 Comparision of three deproteinization methods（n＝3）

3 討論與結論

聚酰胺是一種吸附型色譜，它可以根據物質中所含的氨基、羥基、氫鍵與共軛雙鍵的多少對物質進行吸附。一方面，由于蛋白質分子中富含氨基和氫鍵，因此蛋白質分子可以被聚酰胺吸附，并且去離子水不能將其從聚酰胺色譜柱上洗脫下來［14］；另一方面，雖然多糖是一種多羥基結構的物質，但多糖易于形成分子內氫鍵導致它與聚酰胺形成氫鍵的能力減弱［19］。因此，蛋白質吸附在聚酰胺色譜柱上，而多糖則被去離子水洗脫下來，從而達到將多糖與蛋白質分離的目的。

在以往多糖的分離純化過程中多采用Sevag法脫蛋白，但Sevag法往往要重復多次才能達到脫除蛋白質的目的，且操作所使用的有機溶劑為氯仿、正丁醇等，對操作人員的安全有一定影響，而且萃取蛋白后的有機試劑無法完全回收使用，客觀上對環境也會產生一定的污染。三氯乙酸酸性較強，在使蛋白質變性的同時也易使多糖結構發生變化［22］，如果在此工藝下繼續純化多糖，還需對多糖溶液進行中和，也會對多糖的鑒定造成局部影響。

而聚酰胺法在設定的條件下，一次脫除蛋白的效果就優于Sevag試劑法和三氯乙酸法，并且聚酰胺可循環使用。同時，使用去離子水作為溶劑，對比其他方法使用有機溶劑或者酸性較強的溶劑而言，對操作人員和環境均無負面影響。因此聚酰胺脫蛋白質是一種值得推廣的方法。

本研究結果還發現，聚酰胺在脫除蛋白的同時，對長沙青皮竹多糖也有一定的影響，損失率為30.86%，且損失率隨著聚酰胺用量的增加而增加，較文獻［14］、［19］報道的西藏靈菇胞外多糖、枸杞多糖損失率都要高。推測長沙青皮竹多糖中應有部分多糖在結構上綴有蛋白，導致聚酰胺對這部份多糖也有吸附作用，這一現象為今后開展長沙青皮竹多糖的結構鑒定提供了一些研究思路，相關研究結果將另文報道。

1 羅健夫.湖南觀賞竹類植物的園林應用現狀及對策［J］.世界竹藤通訊，2010，8（1）：27～29.

2 Lv Z，Dong J，Zhang B.Rapid identification and detection of flavonoids compounds from bamboo leaves by LC－（ESI）－ITTOF／MS［J］.Bio.Resources，2012，7（2）：1 405～1 418.

3 陳世軍，鄒洪濤，楊艷.金櫻子 竹葉復合飲料的研制［J］.食品與機械，2006，22（5）：109～111.

4 石亞中，伍亞華，許暉，等.竹葉黃酮與VC、VE復配對冷凍豬肉品質的影響［J］.食品與機械，2013，29（1）：180～183.

5 丁紅秀，高蔭榆，晁紅娟，等.毛竹葉多糖抗疲勞作用研究［J］.食品科學，2008，29（4）：389～391.

6 Mao JW，Yin J，Ge Q，et al.In vitro antioxidant activities of polysaccharides extracted from Moso Bamboo－Leaf［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2013（55）：1～5.

7 丁紅秀，高蔭榆，晁紅娟，等.毛竹葉多糖對高脂血癥小鼠的降脂利肝作用［J］.食品科學，2010，31（9）：259～262.

8 譚周進，謝達平，李立恒，等.蜜環菌多糖分離純化及性質的研究［J］.食品與機械，2002（4）：13～15.

9 Surenjav U，Zhang L，Xu X，et al.Effects of molecular structure on antitumor activities of （1→3）－β－D－glucans from different Lentinus Edodes［J］.Carbohydrate Polymers，2006，63（1）：97～104.

10 周躍斌，王偉，周向榮，等.毛竹竹葉多糖分離與純化技術研究［J］.食品科學，2008，29（7）：156～159.

11 王麗華，李元瑞，陳懿，等.姫松茸多糖脫蛋白質方法的研究［J］.食品科技，2003（1）：18～19.

12 高英春，陳鈞.山藥粗多糖脫蛋白質方法的對比研究［J］.食品科技，2009，34（6）：71～74.

13 秦俊哲，張慧洋.大孔吸附樹脂去除桑黃粗多糖中蛋白質的研究［J］.食品工業科技，2010，12（3）：263～264.

14 孟利，張蘭威.聚酰胺柱層析法去除西藏靈菇胞外多糖發酵液中蛋白質的研究［J］.食品工業科技，2007，28（10）：186～188.

15 方積年，丁侃.天然藥物－多糖的主要生物活性及分離純化方法［J］.中國天然藥物，2007，5（5）：338～345.

16 顏棟美，李仁菊.膜分離與聚酰胺吸附對金花茶多酚的純化［J］.食品與機械，2010，26（1）：42～43.

17 王克勤，嚴志慧，羅軍武，等.聚酰胺樹脂分離純化芹菜黃酮的工藝研究［J］.食品與機械，2009，25（3）：46～50.

18 包琦瑛.聚酰胺樹脂在分離提取領域中的應用［J］.浙江中醫藥大學學報，2009，33（4）：611～612.

19 張民.枸杞多糖的特性、結構及生物活性評價［D］.武漢：華中農業大學，2003.

20 周躍斌，王偉，周向榮.苯酚－硫酸比色法測定毛竹葉多糖的研究［J］.現代食品科技，2008，24（2）：180～183.

21 王文平，郭祀遠，李琳，等.考馬斯亮藍法測定野木瓜多糖中蛋白質的含量［J］.食品研究與開發，2008，29（1）：115～117.

22 董英，張艷芳，孫艷輝.水飛薊粗多糖脫蛋白方法的比較［J］.食品科學，2007，28（12）：82～84.