復(fù)方刺山柑膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

袁 濤 楊偉俊 羅玉琴 薛文采 程 波

1.新疆維吾爾自治區(qū)克拉瑪依市中心醫(yī)院，新疆克拉瑪依 834000；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所新疆維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830004；3.中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所 中國(guó)科學(xué)院干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830011

復(fù)方刺山柑膠囊是通過(guò)臨床經(jīng)驗(yàn)結(jié)合現(xiàn)代藥物配伍篩選技術(shù)自主研發(fā)的復(fù)方藥物，處方由刺山柑、川西獐牙菜、波棱瓜子、大黃、苦荬菜、木香、兔耳草、唐古特烏頭、角茴香、甘草、金錢(qián)草、訶子、黃芪等多味藥材組成，具有清熱解毒、疏肝利膽、利濕退黃之功能，用于急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎屬肝膽溫?zé)嶙C者。課題組前期根據(jù)處方各藥味所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)結(jié)合本方功效，優(yōu)化了復(fù)方刺山柑膠囊的提取工藝[1]，并制備成膠囊劑。本文此其基礎(chǔ)上進(jìn)行制劑的質(zhì)量研究，為臨床用藥安全和有效提供質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

復(fù)方刺山柑膠囊（批號(hào):100402、100403、100404、100405、100415、100416、100417、100723、100724）；大黃素（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):0756-200110）；大黃酚對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，含量測(cè)定用，批號(hào):0796-200208）；齊墩果酸對(duì)照品 （中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，含量測(cè)定用，批號(hào):110709-201206）；黃芪甲苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，含量測(cè)定用，批號(hào):110781-200613）；沒(méi)食子酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，含量測(cè)定用，批號(hào):110831-200803）；木香對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):120921-201008）；訶子對(duì)照藥材 （中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):121015-201004）；川西獐牙菜對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):121354-200401）；大黃對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):120984-201202）。薄層層析用硅膠G（化學(xué)純，青島海洋化工有限公司）；甲醇為色譜純（美國(guó)Fisher公司），其他試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

Shimadzu-LC 2010C全自動(dòng)液相色譜儀，Shimadzu CLASS-VP V6.14SP1數(shù)據(jù)工作站 （日本島津制造所）；LibrorAEG-200電子天平（日本島津制造所）；WHF-203B暗箱式三用紫外分析儀 （上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；Milliporesimplicity-185超純水器 （美國(guó)密理博公司）；KQ-100DE型數(shù)控超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 薄層色譜鑒別

2.1 川西獐牙菜的鑒別

取本品內(nèi)容物5 g，加乙醇30 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液加水15 mL和鹽酸2 mL，加熱回流1 h，放冷，加石油醚（60～90℃）40 mL振搖提取，提取液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取川西獐牙菜對(duì)照藥材2 g，加乙醇20 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取齊墩果酸對(duì)照品，加乙醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，點(diǎn)樣量均為10 μL，采用硅膠G薄層板，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯（5∶2∶1），展開(kāi)，取出，晾干，顯色劑為10%的硫酸乙醇溶液，105℃加熱顯色。在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2 大黃的鑒別

取本品內(nèi)容物2 g，加20 mL甲醇，超聲處理15 min，濾過(guò)，濾液揮干，用20 mL水，溶解后加鹽酸2 mL，加熱回流20 min，立即冷卻，用乙醚振搖提（2次 ×20 mL），合并乙醚液，蒸干，用1 mL三氯甲烷溶解后即為供試品溶液。取大黃對(duì)照藥材0.5 g，按供試品溶液制備方法處理成對(duì)照藥材溶液。再取大黃酸對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，點(diǎn)樣量均為5 μL，采用硅膠G薄層板，展開(kāi)劑為石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液，展開(kāi)，取出，晾干，置365 nm紫外光燈下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)；置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色。

2.3 黃芪的鑒別

取本品內(nèi)容物6 g，加甲醇80 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，濾過(guò)，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取 （3次×40 mL），合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次50 mL，取正丁醇液，再用正丁醇飽和的水洗滌（2次×50 mL），正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，放冷，通過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂（內(nèi)徑1.5 cm，長(zhǎng)12 cm），以水80 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇50 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對(duì)參照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，點(diǎn)樣量均為10 μL，采用硅膠G薄層板，展開(kāi)劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下層溶液，顯色劑為10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱顯色。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.4 木香的鑒別

取本品內(nèi)容物3 g，加乙醚15 mL，振搖5 min，放置2 h，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取木香對(duì)照藥材1 g，加乙醇10 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。參照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，點(diǎn)樣量均為10 μL，采用硅膠G 薄層板，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-丙酮（10∶3），展開(kāi)，取出，晾干，顯色劑為5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱顯。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.5 訶子的鑒別

取本品內(nèi)容物2 g，加乙醇10 mL，超聲處理10 min，放置30 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取訶子對(duì)照藥材1 g，加乙醇5 mL，同供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。再取沒(méi)食子酸對(duì)照品，加乙醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，點(diǎn)樣量均為5 μL，采用硅膠 GF254 薄層板，展開(kāi)劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1），展開(kāi)，取出，晾干，置254 nm紫外光燈下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

3 大黃素和大黃酚含量測(cè)定[2]

3.1 色譜條件

Kromasil ODS-l色譜柱 （250 mm× 4.6 mm，5 μm）；甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）為流動(dòng)相；柱溫:30℃；以 254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取大黃素、大黃酚對(duì)照品各5 mg，分別置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密吸取大黃素溶液1 mL、大黃酚溶液2 mL，分別置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（大黃素每1 mL中含2 μg，大黃酚每毫升中含 4 μg）。

3.3 供試品溶液的制備

取本品約1.0 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加8%鹽酸20 mL，超聲處理5 min，再加三氯甲烷20 mL，加熱回流1 h，冷卻，移置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液用三氯甲烷提取（2次×10 mL），合并三氯甲烷液，置水浴上揮干溶劑，殘?jiān)舆m量甲醇微熱使溶解，移入50 mL量瓶中，用少量甲醇分次洗滌容器，洗液移入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按本品處方比例稱取缺大黃的其余藥味，按生產(chǎn)工藝制成陰性對(duì)照，取陰性對(duì)照細(xì)粉約1 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，依供試品溶液制備方法項(xiàng)下自“加8%鹽酸20 mL……”起，制備陰性對(duì)照溶液。

在上述條件下，各蒽醌類成分與供試品溶液中其他色譜峰達(dá)到了基線分離，陰性對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果表明無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

3.5 線性關(guān)系考察

3.5.1 大黃素線性范圍考察 精密稱取大黃素對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含0.096 mg的溶液，搖勻，精密量取1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。分別精密量取貯備液1、2、3、4 mL置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成每毫升含0.768、1.536、2.304、3.072 μg的溶液。分別精密吸取上述梯度濃度的對(duì)照品溶液與貯備液10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=33319 C+1536.1，r＝0.9996。表明在0.768～3.840 μg/mL范圍內(nèi)，大黃素峰面積與進(jìn)樣濃度具有良好的線性關(guān)系。

3.5.2 大黃酚線性范圍考察 精密稱取大黃酚對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含0.102 mg的溶液，作為貯備液。分別精密量取貯備液 0.5、1、2、3、4 mL 置 25 mL量瓶中， 加甲醇分別制成每毫升含 2.04、4.08、8.16、12.24、16.32 μg 的溶液。分別精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=39750 C+22239，r＝ 0.9993。表明在 2.04～16.32 μg/mL 范圍內(nèi)，大黃酚峰面積與進(jìn)樣濃度具有良好的線性關(guān)系。

3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

同一批樣品（批號(hào):100402）按照上述供試品制備方法制成供試品溶液，在上述色譜條件下，每隔2 h進(jìn)樣1次，每次10 μL，計(jì)算大黃素和大黃酚總量的RSD為0.49%。

3.7 精密度

圖1 復(fù)方刺山柑膠囊中大黃HPLC圖譜

3.7.1 重復(fù)性 取同一份供試品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，峰面積的RSD:大黃素為1.56%，大黃酚為1.24%。

3.7.2 日間精密度 取同一批樣品（批號(hào):100402）分別在不同天（連續(xù)5 d），按照上述供試品制備方法制成供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算大黃素和大黃酚總量的RSD為0.70%。

3.8 回收率測(cè)定

3.8.1 大黃素 精密稱取供試品細(xì)粉0.5 g，共10份，其中一組為空白組，其余分三組，分別加入0.096 mg/mL的大黃素對(duì)照品溶液0.31、0.62、1.05 mL，照供試品溶液制備方法處理后，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL，計(jì)算回收量和回收率，結(jié)果表明，9次測(cè)定的平均回收率為100.00%（n=9），RSD 為 1.18%（n=9）。見(jiàn)表 1。

表1 大黃素回收率測(cè)定結(jié)果

3.8.2 大黃酚 精密稱取供試品細(xì)粉0.5 g，共10份，其中一組為空白組，其余分三組，分別加入0.102 mg/mL的大黃酚對(duì)照品溶液1、2、3.5 mL，照供試品溶液制備方法處理后，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL，計(jì)算回收量和回收率，9次測(cè)定的平均回收率為100.62%（n=9），RSD 為 0.38%（n=9）。見(jiàn)表2。

表2 大黃酚回收率測(cè)定結(jié)果

3.9 10批樣品測(cè)定

對(duì)制備的10批樣品（其中3批為中試規(guī)模）進(jìn)行含量測(cè)定，每批樣品重復(fù)測(cè)定2次，計(jì)算平均值，結(jié)果見(jiàn)表3。

考慮到藥材的產(chǎn)地來(lái)源，以及制劑生產(chǎn)、儲(chǔ)藏等因素，暫定本品每克含大黃以大黃素和大黃酚總量計(jì)，不得低于0.35 mg。按每粒裝0.36 g計(jì)算，限度0.13 mg/粒。

4 討論

4.1 質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇依據(jù)

選擇合理的質(zhì)量控制指標(biāo)是中藥復(fù)方藥物研究的關(guān)鍵點(diǎn)，也是難點(diǎn)，而將工藝篩選研究中的考察指標(biāo)納入質(zhì)量控制體系不僅能夠追蹤藥效成分或化學(xué)成分的轉(zhuǎn)移過(guò)程，而且有利于驗(yàn)證工藝路線的穩(wěn)定性和可行性。本品工藝研究中，有學(xué)者采用80%乙醇提取了川西獐芽菜、大黃、木香等藥味，其總蒽醌提取率達(dá)13.09～17.62 mg/g，正丁醇萃取物得率為13.31～16.32 mg/g，三氯甲烷萃取物得率達(dá)7.22～9.64 mg/g[1]。本文通過(guò)對(duì)大黃中兩種蒽醌類成分的測(cè)定，計(jì)算其轉(zhuǎn)移率達(dá)65%以上，與工藝研究結(jié)果吻合。川西獐芽菜[3-5]、大黃[6]、木香[7]中脂溶性成分具有保肝利膽作用，通過(guò)定性研究，對(duì)脂溶性有效成分進(jìn)行了有效控制。針對(duì)訶子[8]、黃芪[9-10]中含大量多糖和鞣質(zhì)類成分及與本方功能主治緊密結(jié)合的特點(diǎn)，提取工藝采用復(fù)方共煎，本文對(duì)二味進(jìn)行TLC鑒別研究。本研究兼顧了提取工藝的考察指標(biāo)，最大限度地保證了臨床的安全有效和質(zhì)量可控。

表3 10批樣品中大黃素和大黃酚總量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

4.2 最小檢測(cè)限、定量限測(cè)定

根據(jù)復(fù)方中大黃素和大黃酚含量較低的特點(diǎn)，研究中分別配制濃度適當(dāng)?shù)拇簏S素和大黃酚對(duì)照品溶液，在含量測(cè)定色譜條件下進(jìn)樣10 μL，結(jié)果表明大黃素的最小檢測(cè)濃度約 0.261 μg/mL（信噪比 S/N=3），定量濃度約 0.384 μg/mL（信噪比S/N=10）；大黃酚的最小檢測(cè)濃度約0.163 μg/mL（信噪比 S/N=3），定量濃度約 0.408 μg/mL（信噪比 S/N=10）。檢測(cè)結(jié)果表明本品測(cè)定濃度遠(yuǎn)高于兩種含量測(cè)定指標(biāo)的定量限，為定量測(cè)定提供了依據(jù)。

中藥復(fù)方的成分復(fù)雜，采用幾個(gè)指標(biāo)成分或藥效成分進(jìn)行定性定量研究難以全面控制產(chǎn)品質(zhì)量，課題組對(duì)處方中刺山柑的化學(xué)成分和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究[11-12]，同時(shí)對(duì)其他藥味均進(jìn)行了質(zhì)量控制研究，因?qū)傩圆粡?qiáng)或無(wú)對(duì)照物質(zhì)，無(wú)法作為質(zhì)量控制指標(biāo)。今后還需要深入研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，建立能夠全面控制本品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。

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