順鉑預處理對C I K殺傷非霍奇金淋巴瘤細胞的影響

王 昊 柴 曄 陳慧玲 李志虎 張連生

蘭州大學第二醫院血液科，甘肅蘭州 730000

非霍奇金淋巴瘤作為一種惡性腫瘤日益危害著人類的健康，如何治療和提高治療效果成為臨床醫務工作者的研究關鍵。大量的臨床和臨床前期研究表明順鉑 （cisplatinum-diamino-dichloride，DDP）和細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killer，CIK）具有顯著的抗腫瘤作用[1-2]，且治療非霍奇金淋巴瘤具有良好效果[3]。DDP預處理可以增強CIK細胞對部分癌細胞的殺傷作用[4-6]。本文研究目的主要是通過細胞體外培養的方法研究經順鉑預處理后，是否可以增強CIK細胞殺傷淋巴瘤細胞的殺傷活性，為臨床應用化療聯合CIK細胞治療非霍奇金淋巴瘤提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

DDP購自齊魯制藥（海南）有限公司（批號:A1A1212052）；重組人白介素-2（IL-2）購自山東泉港藥業有限公司（批號:201207003）；γ 干擾素（IFN-γ）購自上海凱茂生物有限公司（批號:20121110）；抗CD3單克隆抗體購自Bioscience公司（批號:E06304-1633）；CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit（C34554）購自 Invitrogen 公司（批號:1255942）；碘化丙啶 （PI）購自碧云天生物技術研究所 （編號ST511）；RPMI1640購自GIBCO公司（批號:1161726）；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司（批號:121122）；淋巴細胞分離液購自MP公司（批號:V0711A）；流式細胞儀為美國BD產品。

1.2 實驗細胞

人類非霍奇金淋巴瘤細胞株Namalwa（Burkitt淋巴瘤細胞株）、SU-DHL-4（彌漫大B淋巴瘤細胞株）均購自上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院白血病研究室。實驗細胞株于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，每3天傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 CIK細胞體外培養

抽取健康人外周血50 mL，使用密度梯度離心方法分離外周血取得單個核細胞，把細胞濃度調整為1×106/mL進行后續培養，第1天加入IFN-γ 1000 U/mL，置于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養24 h，然后分別加入重組人白介素-1（IL-1）100 U/mL、重組人 IL-2（IL-2）500 U/mL、抗CD3單克隆抗體50 ng/mL，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中進行培養。以后每3天半量更換新鮮培養液，并補加重組人IL-2，細胞密度調整至1×106/mL，培養期間用流式細胞儀監測細胞免疫表型變化。

1.4 四種DDP濃度預處理后CIK殺傷效果影響

分別向Namalwa細胞、SU-DHL-4細胞中加入濃度為0、25、50、75 μg/L 的 DDP 培養 18 h，再加入 CIK 細胞，CIK細胞與淋巴瘤細胞的效靶比為20∶1，用CFSE/PI雙標法測CIK細胞對靶細胞的殺傷作用。

1.5 三種DDP時間預處理后CIK殺傷效果

分別向Namalwa細胞、SU-DHL-4細胞中加入濃度為25 μg/L 的 DDP，再分別培養 18、24、36 h 后，加入 CIK 細胞，CIK細胞與淋巴瘤細胞的效靶比為20∶1，用CFSE/PI雙標法測CIK細胞對靶細胞的殺傷作用。

1.6 流式細胞儀監測CIK細胞免疫表型變化并檢測CIK細胞對靶細胞的殺傷效果

CIK培養期間用流式細胞儀監測細胞免疫表型變化。細胞樣本采用CFSE/PI雙標法進行檢測。分別收集處理后的細胞樣本上流式細胞儀進行檢測，取30000～50000個細胞進行分析。CFSE的熒光強度在流式檢測時是用FL1熒光通道檢測，PI的熒光強度則是通過FL2熒光通道檢測。CFSE，PI雙陽性的細胞為被殺傷的靶細胞，除以靶細胞總分數，即為殺傷率。實驗重復4次，取4次實驗平均值進行分析。

1.7 統計學方法

采用統計軟件SPSS 15.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIK細胞的培養

細胞換液時進行無菌檢測（細菌、真菌、支原體、病毒等），并取少量CIK細胞培養物加入相應檢測抗體混勻，避光放置25 min后，上流式細胞儀進行檢測，結果顯示CIK細胞在培養 21 d 左右時，CD3+、CD56+和 CD3+CD8+的細胞比例均較理想，細胞活性可保持96%以上，可持續至25 d左右，所以本實驗選擇培養21 d時的CIK細胞進行實驗，見圖1。

圖1 殺傷細胞的免疫表型

2.2 四種DDP濃度預處理后CIK殺傷效果影響

細胞生長達70%融合時，分別向Namalwa細胞、SU-DHL-4細胞中加入濃度為 0、25、50、75 μg/L 的 DDP 培養 18 h，Namalwa 細胞死亡率為 0、（2.70±0.35）%、（7.03±1.40）%、（8.450±0.93）% ，SU-DHL-4 細 胞 死 亡 率 為 0、 （2.30±0.60）%、（5.03±0.84）%、（8.15±0.88）%。加入 CIK 細胞（與淋巴瘤細胞的效靶比為20∶1），CIK聯合四種濃度的DDP殺傷 Namalwa 細 胞的 殺傷 率為 （14.18±2.38）%、（30.73±2.63）%、（43.78±2.52）%、（51.53±1.98）%，殺傷 SU-DHL-4細胞的 殺傷 率為 （13.00±3.34）%、（29.00±2.28）%、（41.75±2.62）%、（50.03±0.90）%（圖 2）。結果顯示，DDP 預處理濃度增加，CIK殺傷靶細胞效應增強。

圖2 不同濃度順鉑預處理，殺傷細胞對淋巴瘤細胞的殺傷作用

2.3 三種DDP時間預處理后CIK殺傷效果影響

在兩種淋巴瘤細胞中分別加入25 μg/L的DDP分別培養 18、24、36 h，DDP 對 Namalwa細胞殺傷率分別為（2.70±0.35）%、（4.47±1.02）%、（5.83±0.78）%，DDP 對 SUDHL-4細胞的殺傷率分別為（2.30±0.60）%、（3.50±1.17）%、（5.43±0.66）%。加入 CIK 細胞（與淋巴瘤細胞的效靶比為20∶1），在不同時間點，DDP聯合CIK對Namalwa細胞的殺傷效應為 （30.73±2.63）%、（40.75±2.33）%、（46.70±3.74）%，對 SU-DHL-4 細胞的殺傷效應為（29.00±2.28）%、（39.35±1.79）%、（42.40±3.04）%。結果顯示，DDP 作用靶細胞24 h后，有顯著的靶細胞死亡。隨著DDP預處理時間延長，再聯合CIK細胞，靶細胞的死亡率增加（圖3）。

圖3 不同時間DDP預處理，CIK對淋巴瘤細胞的殺傷作用

3 討論

DDP被廣泛應用于臨床，但需很高劑量，順鉑的藥理作用才能發揮，治療過程中會出現許多不良反應，例如惡心、嘔吐、食欲減退、腎及泌尿系損害等[7]。怎樣使化療增效，成為研究者的難題。1991年，一類由多種細胞因子誘導的殺傷細胞由斯坦福大學的Schmidt等[8]首先報道。長期大量研究表明CIK細胞具有可大量增殖、對多種腫瘤細胞殺傷活性強大、非MHC限制性、對自身組織無細胞毒作用等優點[9-10]。CIK為多種細胞混合體，其殺傷機制為，CIK細胞在受到刺激時，會釋放以CD3+CD56+雙陽性細胞為最大顆粒釋放量的具有細胞毒性的胞質顆粒物，作為外源性局部定向的細胞溶解毒素，通過細胞膜滲透，直接殺傷腫瘤細胞。CIK細胞活化后產生大量炎癥細胞因子，如TNF-α、IL-2、GM-CSF等，既可直接抑制腫瘤細胞，又可通過調節機體免疫系統反應，間接殺傷腫瘤細胞。許多腫瘤細胞表達FasL，誘導免疫效應細胞凋亡，使免疫治療成功性減低。體外培養過程中，CIK細胞表達FasL，可以通過對FasL陽性腫瘤細胞的誘導凋亡，長期慢性殺傷腫瘤細胞，也對FasL陽性腫瘤所致的凋亡有對抗作用[11-13]。

近年來，已有化療聯合CIK細胞協同治療腫瘤的相關報道，可提高肺癌、乳腺癌、胃癌、惡性黑色素瘤等的治療效果[4-5，14]。本實驗研究經順鉑預處理后對CIK細胞殺傷非霍奇金淋巴瘤細胞的影響。實驗選取人類NHL細胞Namalwa細胞、SU-DHL-4細胞，經不同DDP濃度及時間預處理后，發現CIK殺傷靶細胞效應隨DDP濃度增加、時間延長均增強。實驗顯示低濃度、短時間DDP對靶細胞的殺傷效果欠佳，但聯合CIK后可使靶細胞明顯死亡。據文獻報道，其增效作用可能依賴于機體T淋巴細胞。內源性T淋巴細胞群包含兩部分，即腫瘤抑制性及促進性亞群。腫瘤抑制性T淋巴細胞亞群可與CIK細胞共同抑制腫瘤細胞生長。DDP預處理后，可促進發生免疫調節性腫瘤抑制作用，并可增強CIK免疫治療療效。Treg為重要腫瘤促進性T淋巴細胞亞群細胞，DDP預處理后，腫瘤微環境中的比例下降，促進免疫應答發生，抑制腫瘤生長[15]。

綜上所述，與單用CIK細胞治療相比，DDP預處理后聯合CIK對淋巴瘤細胞更具殺傷作用，可大幅提高腫瘤細胞的殺傷率。本實驗可進行進一步研究，更好地為化療聯合免疫治療的臨床應用提供依據。

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