Ghrelin對大鼠心肌梗死后血管重構(gòu)的影響及機(jī)制研究

袁明杰 孔 彬 權(quán) 力 胡紅耀 王少波 唐艷紅

武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北武漢 430060

心肌梗死（MI）后心室主要重構(gòu)過程包含心室擴(kuò)張、纖維化，最終導(dǎo)致心功能異常。有療效的誘導(dǎo)血管再生對于MI后的慢性心肌缺血和相關(guān)的重塑是一種很有前景的治療方法[1]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是血管生成的一個(gè)重要引發(fā)劑[2]。Ghrelin是從人類和大鼠胃里分離出的一個(gè)28-氨基酸多肽，并在1999年認(rèn)定為一個(gè)GHS-R1A型的內(nèi)源性配體，這已被證明作用在心臟和血管里[3-4]。人工培養(yǎng)的心肌細(xì)胞能夠合成Ghrelin。Ghrelin除對心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用外，Ghrelin及其受體在人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMVEC）中有表達(dá)，并且Ghrelin通過ERK2信號的激活，刺激HMVEC的增殖、遷移和血管生成[5]。另外，Ghrelin表達(dá)量的減少是血管生成后老化相關(guān)損害的影響因素之一[6]。目前，Ghrelin是否能促進(jìn)心肌梗死后的活體動物模型心肌血管生成及其可能的機(jī)制仍未明確。因此，本研究旨在通過建立心肌梗死大鼠模型，研究Ghrelin對心肌血管在成的影響，并試圖闡明其相關(guān)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Ghrelin購自美國Alexis公司；日本Bioer定量PCR檢測系統(tǒng)；S-P免疫組化染色試劑盒購自于深圳晶美生物科技公司；DBA顯示試劑盒購自于深圳晶美生物科技公司；抗兔多克隆抗體及化學(xué)發(fā)光工具包購自于碧云天生物技術(shù)研究所；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）購自于武漢博士德公司。

1.2 動物模型制作及分組

清潔級健康雄性SD大鼠，10周齡，體重為200～250 g購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔給藥麻醉動物后氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)，然后暴露心臟，在左心耳與肺動脈圓錐之間結(jié)扎冠脈前降支制成心肌梗死（MI）模型。納入實(shí)驗(yàn)的雄性SD大鼠65只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（15只），心肌梗死鹽水組（25 只），心肌梗死 Ghrelin 組（25 只）。

1.3 藥物干預(yù)

在MI模型成功建立后第7天，開始藥物干預(yù)。心肌梗死Ghrelin組大鼠按100 μg/kg皮下注射大鼠Ghrelin，每天兩次，假手術(shù)組及心肌梗死鹽水組在相應(yīng)部位注射生理鹽水，給藥時(shí)間為4周。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）方法檢測VEGF mRNA表達(dá)

取梗死邊緣區(qū)左室心肌組織100～150 g，加入l mL Trizol，冰上勻漿，提取總RNA，并合成cDNA。所有引物均參照GenBank提供的序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)，由上海生物工程公司合成。引物序列如下:VEGF（15 bp）:上游5′-GGGATGATGACGACCTGC-3′，下游 5′CCACTTGTTGGCTTATGTT-3′；GAPD （10 bp）:上游 5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游 5′-TTGCGTTTCCAAAGTAAGTG-3′；反應(yīng)條件:第1次循環(huán)94℃預(yù)變性 1 min，其后以94℃變性1 min；56℃退火 15 s，72℃延伸 5s，循環(huán) 50 次，最后 72℃5 min終止。反應(yīng)完成后計(jì)算機(jī)自動分析Ct值。Ct值定義為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)。根據(jù)溶解曲線和產(chǎn)物電泳結(jié)果判斷反應(yīng)產(chǎn)物特異性。

1.5 Western Blot方法分析檢測VEGF蛋白表達(dá)

取梗死邊緣區(qū)心肌組織，按照蛋白抽提試劑盒說明書分離提取胞漿蛋白。利用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。置于5%脫脂奶粉中室溫封閉l h，加入1∶500稀釋的一抗（VEGF多克隆抗體）和1∶2000的磷酸甘油醛脫氫酶抗體，4℃孵育過夜。T-TBS洗滌3次后加入l∶1500稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（抗兔IgG）中室溫下孵育1h，然后T-TBS洗膜3次。將膜與增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）反應(yīng)1～5 min后，曝光于X光膠片上，顯影、定影。GAPDH作為上樣內(nèi)參，目的條帶積分光密度值（OD）與上樣內(nèi)參積分OD比較，得出的相對OD值為VEGF蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值為最終結(jié)果。

1.6 免疫組織化學(xué)法分析新生血管的密度

取梗死邊緣區(qū)和非梗死左室心肌組織100～150 mg，免疫組化分析切片組織具體同文獻(xiàn)[7]。小動脈被定義為圓形的，α-SMA 陽性血管直徑>10 μm，直徑>20 μm 為大動脈。通過免疫組化圖像分析系統(tǒng)測量光學(xué)密度，分析血管密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s），多組間比較用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以Kaplan-Meier曲線分析生存率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物存活情況

24 h內(nèi)死亡情況比較:心肌梗死鹽水組與心肌梗死Ghrelin組死亡率分別為18.0%和16.0%（P>0.05）。術(shù)后存活24 h的45只動物進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析顯示，心肌梗死鹽水組和心肌梗死Ghrelin組28 d生存率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（66.1%比81.2%，P>0.05）。對死亡動物解剖分析未見到左室破裂，死亡原因多為急性充血性心力衰竭或心律失常。

2.2 Ghrelin對VEGF表達(dá)的影響

為了闡明血管生成的機(jī)制，在MI后的28 d，收集邊界區(qū)的心肌組織進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR方法和Western blot分析方法對VEGF mRNA和VEGF蛋白含量進(jìn)行測定。與假手術(shù)組相比，心肌梗死鹽水組VEGF mRNA表達(dá)水平顯著降低；與心肌梗死鹽水組相比，心肌梗死Ghrelin組能顯著提高M(jìn)I大鼠降低的 VEGF mRNA表達(dá)量 （0.65±0.05比0.35±0.03，P<0.05）；心肌梗死 Ghrelin 組的 VEGF 蛋白表達(dá)水平顯著提高（0.75±0.04 比 0.50±0.03，P<0.05）。Ghrelin促進(jìn)血管生成可能是由于增加了局部VEGF的表達(dá)。見圖1。

2.3 Ghrelin對梗死區(qū)和梗死周圍血管密度的影響

與心肌梗死鹽水組相比，心肌梗死Ghrelin組血管α-SMA 在心肌梗死部位密度較高 [（6±2.1）/mm2比 （4±1.8）/mm2（P<0.05）]，在梗死邊緣區(qū)密度較高[（25±9.5）/mm2比（15±5.7）/mm2，（P<0.05）]。因此認(rèn)為 Ghrelin 可有效的誘導(dǎo)缺血心肌的血管生成。見圖2。

3 討論

本研究利用MI動物模型證實(shí)了通過Ghrelin治療能夠誘導(dǎo)缺血心肌血管生成。Ghrelin對于MI后的血管重建的積極作用在于增加心肌VEGF的表達(dá)。

圖1 各組大鼠VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的定量比較

圖2 心肌梗死鹽水組與心肌梗死Ghrelin組在梗死區(qū)與梗死周圍血管密度的比較

新生血管形成是梗死愈合過程的一個(gè)主要組成部分，特別是在梗死后早期，以及在后期的重塑階段[8]。新生血管有利于建立側(cè)支循環(huán)并減緩后期重塑的進(jìn)展。VEGF是一個(gè)同型二聚體，在血管新生、動脈粥樣硬化和損傷后應(yīng)答的血管重塑中起著重要的作用[2，9]。基礎(chǔ)和臨床研究資料表明，VEGF能誘導(dǎo)缺血心肌的血管新生，改善心肌梗死心臟的功能[10-11]。過度表達(dá)的VEGF通過促進(jìn)血管生成和抗凋亡作用改善心功能[8]。在愈合期增加的VEGF表達(dá)可促進(jìn)傷口新生血管的形成[10]。在本模型中，筆者發(fā)現(xiàn)Ghrelin進(jìn)一步增加心肌梗死后28 d動物的α-SMA陽性血管密度。Ghrelin增加心肌邊界區(qū)域VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平，這表明Ghrelin使梗死心肌的新生血管增多可能是通過VEGF水平增加所介導(dǎo)的。Ghrelin使新生血管的增加可能改善心功能障礙和防止心臟重塑。

Ghrelin發(fā)揮上述積極作用可能存在如下機(jī)制:①PI3激酶/Akt信號通路在誘導(dǎo)MI后的心肌血管再生中有潛在的作用[12]。已有報(bào)道，胰島素調(diào)控心肌VEGF的基因表達(dá)和血管生成，特別是通過胰島素受體和激活PI3K/Akt通路[4，13]。②ERK1/2 MAP激酶途徑也是通過抑制細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)血管生成的一個(gè)關(guān)鍵的級聯(lián)反應(yīng)[5，14]，Ghrelin通過激活ERK2信號刺激HMVEC增殖、遷移和血管生成[15]。③Ghrelin使體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞 （ECs）和完整的血管內(nèi)的一氧化氮（NO）合酶（eNOS）激活[16-17]。④體內(nèi) Ghrelin干預(yù)可能會加大心臟原始干細(xì)胞增殖或補(bǔ)充外周血干細(xì)胞到梗死的心肌以促進(jìn)血管形成[18]。綜上提示，Ghrelin可能通過不同的信號通路介導(dǎo)血管生成。

綜上所述，本研究顯示Ghrelin能增加MI后心肌VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成。Ghrelin治療可望成為抑制心肌梗死后左室重塑的一種新對策。同時(shí)，Ghrelin對血管生成的作用更為詳細(xì)的信號通路和分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

[1]Haider H，Akbar SA，Ashraf M.Angiomyogenesis for myocardial repair[J].Antioxid Redox Signal，2009，11（8）:1929-1944.

[2]Zhao T，Zhao W，Chen Y，et al.Vascular endothelial growth factor（VEGF）-A:role on cardiac angiogenesis following myocardial infarction[J].Microvasc Res，2010，80（2）:188-194.

[3]Gnanapavan S，Kola B，Bustin SA，et al.The tissue distribution of the mRNA of ghrelin and subtypes of its receptor，GHS-R，in humans[J].J Clin Endocrinol Metab，2002，87（6）:2988.

[4]Kishimoto I，Tokudome T，Hosoda H，et al.Ghrelin and cardiovascular diseases[J].J Cardiol，2012，59（1）:8-13.

[5]Wang L，Chen Q，Li G，et al.Ghrelin stimulates angiogenesis via GHSR1a-dependent MEK/ERK and PI3K/Akt signal pathways in rat cardiac microvascular endothelial cells[J].Peptides，2012，33（1）:92-100.

[6]Ahluwalia A，Li A，Cheng G，et al.Reduced ghrelin in endothelial cells plays important mechanistic role in aging-related impairment of angiogenesis[J].J Physiol Pharmacol，2009，60（2）:29-34.

[7]Yuan MJ，Huang CX，Tang YH，et al.A novel peptide ghrelin inhibits neural remodeling after myocardial infarction in rats[J].Eur J Pharmacol，2009，618（1-3）:52-57.

[8]Hao X，Mansson-Broberg A，Grinnemo KH，et al.Myocardial angiogenesis after plasmid or adenoviral VEGF-A （165） gene transfer in rat myocardial infarction model[J].Cardiovasc Res，2007，73（3）:481-487.

[9]Kajdaniuk D，Marek B，F(xiàn)oltyn W，et al.Vascular endothelial growth factor（VEGF）-part 1:in physiology and pathophysiology[J].Endokrynol Pol，2011，62（5）:444-455.

[10]Schwarz ER，Speakman MT，Patterson M，et al.Evaluation of the effects of intramyocardial injection of DNA expressing vascular endothelial growth factor（VEGF） in a myocardial infarction model in the rat--angiogenesis and angioma formation[J].J Am Coll Cardiol，2000，35（5）:1323-1330.

[11]He Z，Opland DM，Way KJ，et al.Regulation of vascular endothelial growth factor expression and vascularization in the myocardium by insulin receptor and PI3K/Akt pathways in insulin resistance and ischemia[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2006，26（4）:787-793.

[12]Ackah E，Yu J，Zoellner S，et al.Akt1/protein kinase Balpha is critical for ischemic and VEGF-mediated angiogenesis[J].J Clin Invest，2005，115（8）:2119-2127.

[13]Tao Z，Chen B，Tan X，et al.Coexpression of VEGF and angiopoietin-1 promotes angiogenesis and cardiomyocyte proliferation reduces apoptosis in porcine myocardial infarction （MI） heart[J].Proc Natl Acad Sci USA，2010，108（5）:2064-2069.

[14]Zhou L，Ma W，Yang Z，et al.VEGF165 and angiopoietin-1 decreased myocardium infarct size through phosphatidylinositol-3 kinase and Bcl-2 pathways[J].Gene Ther，2005，12（3）:196-202.

[15]Li A，Cheng G，Zhu GH，et al.Ghrelin stimulates angiogenesis in human microvascular endothelial cells:Implications beyond GH release[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，353（2）:238-243.

[16]Chen LL，Yin H，Huang J.Inhibition of TGF-beta1 signaling by eNOS gene transfer improves ventricular remodeling after myocardial infarction through angiogenesis and reduction of apoptosis[J].Cardiovasc Pathol，2007，16（4）:221-230.

[17]Xu X，Jhun BS，Ha CH，et al.Molecular mechanisms of ghrelin-mediated endothelial nitric oxide synthase activation[J].Endocrinology，2008，149（8）:4183-9412.

[18]Gao M，Yang J，Liu G，et al.Ghrelin promotes the differentiation of human embryonic stem cells in infarcted cardiac microenvironment[J].Peptides，2012，34（2）:373-379.