花椒精油抑制赤擬谷盜蟲卵孵化作用的研究

趙雪娜 王建清

(天津科技大學包裝與印刷工程學院，天津 300222)

赤擬谷盜［Tribolium castaneum(Herbst)］為世界性主要的儲糧和干貨類害蟲，尤其在高溫高濕情況下，極易發生蟲蛀危害。目前，主要采用磷化氫熏蒸防治，但長期過度使用導致其產生了不同程度的抗藥性［1］，而且也無法避免在之后的運輸貯藏過程中的蟲害發生。近年來，植物精油對赤擬谷盜的活性研究在國內外已有報道，具有忌避、熏蒸與觸殺作用［2－8］，它低毒、綠色;且由于精油的獨特作用機理，不易產生抗性，既能拓寬精油的用途，又能開創防蟲包裝的新途徑，因此具有廣闊的應用前景。

本研究提取了不同產地的4種花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim)精油，通過對赤擬谷盜蟲卵孵化的抑制作用研究，篩選出效果最好的精油，并對其殺蟲活性進行了進一步地研究，為開發新型無公害的殺蟲劑，研究防蟲包裝提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試蟲卵

赤擬谷盜，取自國家糧食局科學研究院，實驗室飼養，即將赤擬谷盜成蟲接種于以全麥粉和酵母粉按質量比為20∶1混合而成的飼料中，在(30±1)℃、相對濕度(75±5)%、24 h黑暗條件下進行種群培養［9］，待成蟲大量出現時，每日篩出供試1日蟲卵。

篩卵方法:將小麥和酵母粉粉碎，過100目分選篩，配制比例為20∶1、粒徑小于0.15 mm 的飼料，調整水分13%左右;將成蟲接入飼料中，產卵24 h后，先過尼龍紗網，將成蟲篩去;取混有卵的飼料過80目篩，篩上留下的是卵和少量的飼料，篩下的飼料中無卵遺留，可重新飼養成蟲;將載有卵的少量飼料再過60目篩，分選篩上留下的即是1日齡卵(篩下的飼料去除，不再回收入成蟲飼料中)。

1.1.2 供試藥劑

東北青花椒、江津青花椒、漢源紅花椒、韓城紅花椒:安國市祁奧中藥飲品有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 4種花椒精油的水蒸氣蒸餾提取

將花椒粉碎過篩，粒徑30目左右，裁出適當大小的雙層紗布置于1 000 mL的加料瓶底部，然后將100 g花椒粉末用漏斗裝于紗布上。底部1 000 mL的三口燒瓶中裝入約為2/3容積的蒸餾水，加入適量的沸石，三口瓶的一側裝入安全管，另一側裝入傳感器(測溫度)。用加熱套加熱，鐵架臺固定，然后按圖1將水蒸氣蒸餾裝置組裝完成［10］。加熱套的溫度設定為110℃，蒸餾水沸騰后，揮發油測定器里開始有揮發油的油水混合物滴出，適時補充三口燒瓶中的蒸餾水，當蒸餾出的精油不再增加時停止蒸餾。

將蒸餾液取出，用無水硫酸鈉去掉水分，即得花椒精油。前30 min每1 min記錄提取率，30～120 min每10 min記錄提取率，120～300 min每30 min記錄提取率。

圖1 新型的水蒸氣蒸餾裝置

1.2.2 4種花椒精油的GC－MS成分分析

采用氣相色譜－質譜聯用技術(GC－MS)對提取的東北青花椒、江津青花椒、漢源紅花椒、韓城紅花椒精油的成分進行分析。

色譜條件:柱子型號:VF －5ms，30 m ×0.25 mm×0.25 μm，進樣口溫度300 ℃，分流比20，載氣 He，純度99.999%，柱流速1 mL/min;程序升溫:初始溫度60℃，以5℃/min升到200℃，以10℃/min升到300 min，保持 3 min。

質譜條件:離子源:EI，質量分析器:離子阱，阱溫:220℃，傳輸線溫度:280℃，掃描方式:全掃描，掃描范圍:50～1 000 m/z。

數據庫:利用NIST05標準質譜庫－計算機聯機檢索。

樣品的處理及測定:取4種精油用正己烷分別稀釋10 000倍，各取1μL進樣。利用NBS75K標準質譜庫－計算機聯機檢索，與質譜圖集的標準譜圖進行對照、復合，再結合有關文獻，進行人工譜圖解析，確認4種精油的各個化學成分。按面積歸一化法進行成分含量分析，分別計算各個成分的相對百分含量。

1.2.3 熏蒸試驗

對傳統的成蟲三角瓶熏蒸法［11］進行了改進，以適用于蟲卵的熏蒸，具體熏蒸方法如下:在載玻片上貼附雙面膠用于固定蟲卵，用刀片劃分為4格，用毛筆將40粒卵輕輕撥入每格，即每個處理重復4次。將載有卵的載玻片置于250 mL三角瓶的底部，不同量的精油滴于尺寸為1 cm×4 cm的濾紙片上，濾紙片的一端固定在7層共擠薄膜的內表面，使之懸空于三角瓶內，用透明膠帶封合薄膜和三角瓶，保持熏蒸環境密閉。熏蒸48 h后將載有卵的載玻片取出，置于(30±2)℃、相對濕度(70±5)%環境下培養，記錄卵的最終孵化率。

1.2.4 觸殺試驗

濾紙藥膜法［12］(直徑 90 mm，面積 63.5 cm2):用丙酮將精油配成不同濃度的溶液，取1 mL溶液加入到培養皿中的濾紙上，制成濾紙藥膜，待溶劑揮發后(1 h)，每皿接入40粒卵，每個濃度3個重復試驗，處理24 h后取出，置于(30±2)℃、相對濕度(70±5)%環境下繼續培養，記錄卵最終孵化率。

1.2.5 數據處理

試驗結果數據處理采用了EXCEL統計軟件進行數據分析。

死亡率=死亡蟲數/供試蟲數×100%

采用Abbott公式對死亡率進行校正:

校正死亡率=(處理死亡率－對照死亡率)/(1－對照死亡率)×100%［13］

用概率值法求出不同熏蒸處理時間和處理濃度下花椒精油的毒力回歸方程和LC50值［14］。

2 結果與分析

2.1 花椒品種對精油提取率的影響

水沸騰后開始計時，4種花椒精油的提取率隨時間的變化如圖2。從圖2可以看出，30 min內4種花椒精油的提取率升高較快，30 min時東北青花椒、江津青花椒、漢源紅花椒、韓城紅花椒的提取率分別是5%、3.7%、4.6% 和 1.1%，過后提取率趨于平緩。180 min時東北青花椒的提取率達到最高為7.2%，240 min時江津青花椒的提取率達到最高為5.1%，180 min時漢源紅花椒的提取率達到最高為4.6%，120 min時韓城紅花椒的提取率達到最高為2.0%。因此為了節約成本，試驗中采用120 min來提取花椒精油，也可應用于工廠生產中。

圖2 4種花椒精油的提取率變化曲線

2.2 4種花椒精油的主要化學成分分析

圖3 4種花椒精油的總離子流圖

4種花椒精油的總離子圖譜如圖 3，利用NBS75K標準質譜庫－計算機聯機檢索，與質譜圖集的標準譜圖進行對照、復合，進行人工譜圖解析，確認精油的主要化學成分，按面積歸一化法進行成分含量分析，分別計算各個成分的相對百分含量。可以看出，東北青花椒、江津青花椒和漢源紅花椒精油中含量最多的化學成分均是芳樟醇(出峰時間8.969 min)，相對質量分數分別為 68.46%、58.01% 和48.23%，其次是檸檬烯(出峰時間 7.234 min)，相對質量分數分別為 7.53%、9.96%和 19.66%，b －萜品烯(出峰時間 5.929 min)相對質量分數分別為4.13%、8.73%和14.97%。韓城紅花椒精油中的各種化學成分含量都比較少，其中含量相對較高的是檸檬烯12.53%，其他含量比較多的成分包括(1R)－(+)－α蒎烯、b－萜品烯等，而芳樟醇僅占3.70%。芳樟醇和檸檬烯的分子結構式如圖4。

圖4 芳樟醇和檸檬烯的分子結構式

2.3 4種花椒精油對1日卵的熏蒸孵化抑制效果

4種花椒精油對1日卵熏蒸48 h后的校正死亡率如圖5所示，從圖5可以看出，隨著精油熏蒸濃度的升高，卵的孵化率越來越低，校正死亡率越來越高，兩種青花椒精油的效果要優于兩種紅花椒精油，青花椒精油熏蒸濃度54μL/L時卵的校正死亡率已經達到90%以上，其中東北青花椒精油對1日卵的孵化抑制效果是最佳的，致死率96.72%，而江津青花椒、漢源紅花椒和韓城紅花椒精油處理后，卵的校正死亡率分別為92.43%、88%和70.49%。

圖5 4種花椒精油對赤擬谷盜蟲卵熏蒸48 h后的毒力作用

4種花椒精油的熏蒸毒力回歸方程和致死中濃度 LC50如表1，東北青花椒的 LC50是29.28 μL/L，明顯低于其他3種花椒精油，對卵的孵化抑制效果最好，而韓城紅花椒精油的殺蟲效果最差。據文獻報導，青椒精油對赤擬谷盜成蟲和米象成蟲的熏蒸效果優于紅椒精油，且2種花椒精油的持續期長，在高溫下能更好地發揮藥效［15－16］。

表1 4種花椒精油對赤擬谷盜蟲卵的熏蒸毒力(48 h)

空白對照組和熏蒸處理組的蟲卵孵化如圖6(放大1 000倍)。空白對照組的蟲卵正常孵化，在顯微鏡下可以清晰地看到破裂的卵殼和孵化出的幼蟲，隨著精油熏蒸濃度的升高，孵化率隨之下降，當精油熏蒸濃度提高到42μL/L時，卵內細胞質開始皺縮，54μL/L精油處理后，細胞質皺縮率達到50%左右，卵無法孵化。

圖6 東北青花椒精油熏蒸處理后的蟲卵

2.4 4種花椒精油對1日卵的觸殺試驗

4種花椒精油對1日卵進行觸殺試驗后的校正死亡率如圖7所示。從圖7可以看出，隨著精油觸殺用量的升高，卵受到精油的致死影響，孵化率越來越低，校正死亡率越來越高。每個用量下東北青花椒精油的致死效果都是最好的，江津青花椒和漢源紅花椒效果相近，而韓城紅花椒在低用量時觸殺效果較差。當東北青花椒精油觸殺用量3.6μL/cm2時，對1日卵孵化的抑制率高達97.85%。另外3種花椒精油校正死亡率為85.71%、86.44%和85.23%，還未完全抑制卵的孵化繁殖。

圖7 4種花椒精油對赤擬谷盜蟲卵的觸殺毒力作用

4種花椒精油的觸殺毒力回歸方程和致死中量LD50如表2，東北青花椒的 LD50是1.02 μL/cm2，明顯低于其他3種花椒精油，殺蟲效力最佳。與熏蒸毒力效果類似，韓城紅花椒的毒力效果較差。

表2 4種花椒精油對赤擬谷盜蟲卵的觸殺毒力

綜合熏蒸試驗結果和觸殺試驗結果，選定東北青花椒精油進行后續研究，探索其對赤擬谷盜蟲卵的毒力效果。通過GC－MS分析結果看，東北青花椒精油中芳樟醇含量最高，江津青花椒和漢源紅花椒精油次之，韓城紅花椒精油最少，從殺卵效果來看，前3者也較好，而韓城紅花椒精油效果最差。另外，雖然后3者的檸檬烯含量較高，但是殺蟲效果卻次于東北青花椒精油。由此可以看出花椒精油中芳樟醇對赤擬谷盜蟲卵的孵化抑制效果是最明顯的，是殺卵的主要成分。這與路春明等［4］的研究成果類似。

2.5 在不同熏蒸時間下，東北青花椒精油熏蒸濃度對赤擬谷盜蟲卵熏蒸毒力的影響

東北青花椒精油熏蒸24 h的熏蒸濃度設定為30、36、42、48、54、60、66 μL/L，熏蒸 48 h 的熏蒸濃度設定為18、24、30、36、42、48、54 μL/L，熏蒸72 h 的熏蒸濃度設定為 6、12、18 、24、30、36、42 μL/L，如圖 8，精油熏蒸濃度為54μL/L時，熏蒸24 h后使得蟲卵的校正死亡率達到了94%，48μL/L時熏蒸48 h后校正死亡率達到91%，差別不是特別大，但是當熏蒸時間達到72 h后，36μL/L的精油熏蒸濃度可以達到95%的致死率，殺蟲效力大大增加，也就是隨著精油熏蒸濃度的增加，較短的時間就可以達到較高的致死效果。

圖8 東北青花椒精油熏蒸濃度對赤擬谷盜蟲卵的毒力影響

東北青花椒精油的熏蒸毒力回歸方程和致死中濃度LC50如表3。隨著時間的延長，LC50值逐漸減小，并且熏蒸72 h與48 h和24 h的LC50差別比較大，熏蒸活性增幅明顯，說明精油效果具有較長的持續期，熏蒸時間越長效果越好，因此，適當延長熏蒸時間可以減少用藥量。

表3 東北青花椒精油熏蒸時間對赤擬谷盜蟲卵的毒力

2.6 在不同熏蒸濃度下，東北青花椒精油熏蒸時間對赤擬谷盜蟲卵熏蒸毒力的影響

2.6.1 東北青花椒精油對1日卵熏蒸試驗

用20、30、40、50 μL/L 的精油對1 日卵進行 12、18、24、36、42、48、60、72 h 的熏蒸，確定其校正死亡率達到50%的時間段。如圖9，在熏蒸濃度為20 μL/L時，熏蒸72 h后的校正死亡率為45.38%，還沒有達到50%的致死率，可以去除這個濃度。熏蒸濃度為30μL/L時，在42～60 h中，校正死亡率由45.86%升至 63.91%;熏蒸濃度為 40 μL/L時，在18 ～36 h中，校正死亡率由 40.77%升至 56.92%;熏蒸濃度為50μL/L時，熏蒸18 h后，校正死亡率達到60.90%。因此，選定精油熏蒸濃度為30、40和50 μL/L，熏蒸時間段分別為42～60 h、18～36 h和1～19 h進行致死中時間LT50的測定。

圖9 東北青花椒精油熏蒸時間對赤擬谷盜蟲卵的毒力影響

2.6.2 東北青花椒精油對1日卵熏蒸致死中時間LT50的測定

3種濃度的精油對1日卵進行熏蒸處理，精油熏蒸濃度為 30 μL/L 時分別熏蒸 42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 h;40 μL/L 時分別熏蒸 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h;50 μL/L 時分別熏蒸 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19 h;通過對不同濃度的東北青花椒精油的熏蒸毒力進行回歸分析，結果如表4。熏蒸濃度為30μL/L的LT50為45.11 h，40 μL/L的 LT50為 29.41 h，50 μL/L 的 LT50為12.98 h，因此東北青花椒精油熏蒸濃度和赤擬谷盜蟲卵的活性有密切的關系，可以根據實際需要，選擇合適的熏蒸濃度和熏蒸時間，達到較好的熏蒸效果。

表4 東北青花椒精油熏蒸濃度對赤擬谷盜蟲卵的毒力

3 結論

從研究結果可以看出，花椒精油的提取率比較高，工業生產中可以提取120 min以節約成本。4種花椒精油對赤擬谷盜蟲卵的孵化具有較好的抑制作用，尤其是東北青花椒精油的效果更佳，提取率更高。試驗在250 mL空三角瓶中研究了東北青花椒精油對赤擬谷盜1日卵的熏蒸效果，熏蒸24、48和72 h 的 LC50分別為 34.82、29.28 和 16.48 μL/L，熏蒸時間越長，所需的精油濃度依次降低。精油熏蒸濃度分別為30、40和50μL/L時致死中時間LT50分別為45.11、29.41 和 12.98 h。精油熏蒸濃度越高，達到抑制效果的時間越短，這對于之后在儲糧或干貨防蟲方面的實際應用提供了指導意義。國內外針對赤擬谷盜的研究主要涉及幼蟲和成蟲方面的研究，對赤擬谷盜蟲卵的研究較少，植物精油對于蟲卵的效果相對較差，但作為儲糧防蟲以及防蟲包裝方面，需要從蟲卵態開始進行抑制，因此本研究改進了蟲卵的熏蒸方法，為植物精油在蟲卵熏蒸方面的應用提供了理論依據。

針對本研究結果，今后需要繼續深入研究的問題主要有實倉中精油的滲透力、應用對象對精油的吸附、溫度等的影響對花椒精油熏蒸濃度和熏蒸時間的影響，并探索應用于防蟲包裝中，代替目前的化學熏蒸劑，提高植物殺蟲劑的應用實踐價值。

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