在不同營養水平日糧中添加益生菌對肉雞抗氧化功能、黏膜免疫及回腸菌群的影響

唐志剛 溫 超 王 恬 周巖民

(南京農業大學動物科技學院，南京 210095)

隨著生活水平的提高，畜產品質量受到廣泛關注，飼料所帶來的畜產品安全越來越受到重視。為了提高畜產品質量，人們越來越傾向于無污染、無殘留的飼料添加劑。作為替代抗生素的一種新型綠色添加劑，益生菌能提高家禽生產性能，使飼料利用率提高 3.9%～ 32.2%［1－2］，尤其養殖環境不太理想的情況下效果更佳;同時，益生菌可調節腸道的微生態平衡，提高免疫力，增強機體對內、外環境不良刺激的抵抗能力［3］。但畜禽養殖中，益生菌的促生長、促免疫作用受諸多因素影響，應用效果差異較大。因此，全面認識微生態系統對營養代謝和免疫功能的調控作用就顯得十分重要。目前，有關益生菌的試驗研究大多集中于常規日糧，而在低營養水平日糧中添加益生菌對動物抗氧化功能、黏膜免疫影響的研究則鮮見報道。本試驗通過在不同營養水平日糧中添加益生菌，研究其對肉雞免疫器官指數、抗氧化功能、腸黏膜免疫及腸道菌群的影響，評估益生菌在宿主內的免疫效應并探究其機理，為研發抗生素替代品和節約飼料資源提供理論根據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

益生菌由北京九州互聯農牧有限公司提供，以枯草芽孢桿菌為主要菌種，并包含地衣芽孢桿菌和乳酸桿菌等，產品活菌總數大于1.0×1010CFU/g。

1.2 試驗動物及日糧

1日齡AA肉雞由安徽和威集團提供，試驗為期42 d，其中1～21 d為試驗前期，22～42 d為試驗后期。試驗日糧參照NRC(1994)《家禽的營養需要量》配制(表1)。

表1 日糧的組成及營養水平(風干基礎)/%

1.3 試驗設計與飼養管理

試驗采用2×2雙因素隨機區組設計，選用1日齡肉雞320只，隨機分成4組，每組10個重復，每個重復8只雞，分別飼喂以下4種日糧:

正對照組(NC):基礎日糧;

負對照組(LC):低能低蛋白日糧，使基礎日糧前后期的代謝能均降低320 kJ/kg，粗蛋白均降低0.85%;

試驗1組(NP):基礎日糧+0.01%益生菌，其日糧活菌總數大于1.0×106CFU/g;

試驗2組(LP):低能低蛋白日糧+0.01%益生菌，其日糧活菌總數大于1.0×106CFU/g。

試驗雞于室內同一環境下采用層疊籠飼養，每籠為一重復，24 h光照，每天喂料2次，自由采食和飲水，以重復為單位每天記錄飼料飼喂量和剩余量，每天清洗飲水器和料槽1次。免疫接種及疾病預防、消毒按常規方法進行。

1.4 樣品采集與測定

在試驗的第21天和第42天，每組隨機選取8只中等大小的公雞屠宰，放血致死后迅速剖開腹腔，取脾臟、胸腺、法氏囊并稱重，計算各器官指數。器官指數=器官重/雞活體重。

采集血液置于離心管中，待血清析出后，在低溫離心機中以3 000 r/min離心15 min，取上清液(血清)分裝，測定血清丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T－SOD)和總抗氧化能力(T－AOC)。取十二指腸和空腸前半段，用眼科剪縱向剖開，清除表層食糜后再用載玻片刮取黏膜，將部分黏膜用4℃生理鹽水10倍體積稀釋后勻漿，4℃離心20 min(4 000 r/min)，取上清液分裝，測定黏膜勻漿液的MDA、TSOD和T－AOC。血液和腸黏膜MDA、T－SOD和T－AOC所用試劑盒由南京建成生物工程研究提供。

黏膜免疫球蛋白G(IgG)用競爭性放射免疫分析技術測定(試劑盒由濰坊三維生物工程集團有限公司所提供)。黏膜分泌性免疫球蛋白A(SIgA)采用競爭性放射免疫分析技術測定(試劑盒由原子高科股份有限公司所提供)。

1.5 腸道菌群的測定

分別于試驗的第21天和第42天時，每組隨機選取4只中等大小的公雞屠宰，無菌條件下取回腸內容物0.5 g左右，用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋;采用平板菌落計數法，大腸桿菌使用麥康凱瓊脂培養基37℃有氧培養24 h后進行菌落計數;乳酸桿菌使用MRS瓊脂培養基37℃有氧培養48 h后進行菌落計數，結果以每克腸道內容物中細菌個數的對數lg(CFU/g)表示。

1.6 數據處理

試驗數據采用SPSS16.0軟件GLM模型進行兩因子方差分析，模型主效應包括日糧的營養水平(N/L)、益生菌不添加或添加(C/P)以及二者的互作，用Duncan進行多重比較，結果以“平均值±標準誤”(X±SE)表示。

2 結果

2.1 不同營養水平日糧中添加益生菌對肉雞免疫器官指數的影響

由表2可知，益生菌能極顯著提高21 d肉雞的胸腺指數(P＜0.01)，顯著提高21 d脾臟指數和法氏囊指數(P＜0.05)，對42 d的脾臟指數、胸腺指數和法氏囊指數均沒有顯著影響(P＞0.05);日糧營養水平及其與益生菌的互作對21 d和42 d的脾臟指數、胸腺指數和法氏囊指數均沒有顯著影響(P＞0.05)。

表2 不同營養水平日糧中添加益生菌對免疫器官指數的影響/g/kg

2.2 不同營養水平日糧中添加益生菌對血清抗氧化性能的影響

由表3可知，益生菌能提高肉雞前期血清TSOD的活性(P＜0.05)，降低肉雞前期血清MDA的含量(P＜0.01)，能提高后期血清T－SOD和 TAOC活性(P＜0.01)，降低后期 MDA的含量(P＜0.05);日糧營養水平對血清前、后期的 T－SOD、MDA和T－AOC均無顯著影響(P＞0.05);益生菌和日糧營養水平的互作對血清前期抗氧化功能無顯著影響(P ＞0.05)，對后期 T －SOD(P=0.094)和T－AOC(P=0.060)有提高趨勢，對后期MDA無顯著改變(P ＞0.05)。

表3 不同營養水平日糧中添加益生菌對血清抗氧化功能的影響

2.3 不同營養水平日糧中添加益生菌對黏膜抗氧化性能、免疫功能的影響

由表4可知，益生菌能顯著提高黏膜21 d的TSOD活性(P＜0.05)，對21 d黏膜MDA含量也有一定降低趨勢(P=0.057)，能顯著降低42 d黏膜MDA含量(P＜0.05)，對T－SOD和T－AOC沒有顯著影響(P＞0.05);日糧營養水平對21 d、42 d黏膜抗氧化性能沒有顯著影響(P＞0.05);益生菌和營養水平的互作對黏膜抗氧化影響不大(P＞0.05)。

表4 不同營養水平日糧中添加益生菌對黏膜抗氧化功能的影響

益生菌對飼喂不同營養水平日糧肉雞黏膜IgG和SIgA的影響見表5。益生菌可顯著提高21 d黏膜IgG的含量(P＜0.05)，對21 d黏膜SIgA含量沒有影響(P＞0.05)，顯著提高42 d黏膜IgG和SIgA含量(P＜0.01或P＜0.05);日糧營養水平對肉雞前后期的黏膜IgG和SIgA均沒有顯著影響(P＞0.05)。

表5 不同營養水平日糧中添加益生菌對肉雞黏膜免疫的影響/ng/mg prot

2.4 不同營養水平日糧中添加益生菌對肉雞回腸菌群的影響

如表6所示，益生菌能降低21 d、42 d回腸大腸桿菌數量(P＜0.05)，提高21 d回腸乳酸桿菌的數量(P＜0.001)，對42 d回腸乳酸桿菌數量沒有顯著影響(P＞0.05);日糧營養水平對21 d回腸乳酸桿菌數量有顯著影響(P＜0.05)，對21 d大腸桿菌沒有顯著影響(P＞0.05)，對42 d大腸桿菌、乳酸桿菌數量均沒有影響(P＞0.05);益生菌和日糧營養水平的互作對21 d、42 d回腸菌群均沒有顯著影響(P＞0.05)。

表6 益生菌在不同營養水平下對肉雞腸道菌群的影響/lg(CFU/g)

3 討論

3.1 不同營養水平日糧中添加益生菌對肉雞免疫器官指數的影響

胸腺、法氏囊和脾臟作為肉雞最重要的免疫器官，其發育狀態和機能強弱直接影響家禽的免疫機能［4－5］。益生菌能促進胸腺、法氏囊等免疫器官的生長發育，提高動物對外界刺激和疾病的抵抗力［6］。趙希彥［7］研究表明，添加0.2%芽孢桿菌制劑使21 d肉雞的脾臟指數、法氏囊指數顯著提高。本試驗結果表明，在不同營養水平下添加益生菌，特別是低營養水平日糧中，肉雞前期胸腺指數、脾臟指數和法氏囊指數均有所提高，對肉雞后期的免疫器官指數沒有影響，這表明添加益生菌后，可適當降低日糧營養水平，在保證動物正常生長的同時，可促進肉雞前期的免疫器官發育，完善肉仔雞免疫系統。而肉雞后期自身的免疫功能已健全，應對外界刺激的能力增強，添加益生菌對對肉雞后期免疫器官指數無明顯效果。

3.2 不同營養水平下日糧中添加益生菌對血清抗氧化性能的影響

機體的抗氧化體系是由酶促和非酶促抗氧化體系共同維持的，酶促抗氧化體系主要包括谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶以及過氧化氫酶等，它們可以有效清除O－、H2O2、ROOH等中的活性氧并終止自由基鏈式反應。血液SOD活性、MDA含量以及T－AOC是反映機體抗氧化能力的重要指標。本試驗研究表明，在低營養水平下添加益生菌，都能提高血液T－SOD的活性，降低血液MDA的含量，對T－AOC也有一定提高，這與段穎等［8］、楊家軍等［9］在蛋雞和小鼠中的研究報道一致，提示益生菌能增強機體抗氧化能力，減少過氧化物對機體的損傷。

3.3 不同營養水平下日糧中添加益生菌對肉雞腸道黏膜抗氧化和免疫的影響

腸道黏膜處于溝通機體內外環境的重要位置，黏膜的完整性是維持腸道正常功能的重要保證，對保護腸道具有重要意義。MDA可與蛋白質、核酸(DNA、RNA)和磷脂等含有氨基的物質交聯，引起黏膜或細胞損傷。黏膜中的SOD能夠消除超氧陰離子的毒性，保護黏膜和腸壁細胞免受損傷［10］。有研究表明，益生菌能產生多種抗氧化酶，如超氧化物歧化酶［11］、含錳過氧化氫酶［12］、谷胱甘肽過氧化物酶［13］等，可清除黏膜自由基，防止過氧化反應損害腸道黏膜。本試驗表明，在不同營養水平下添加益生菌能提高肉雞黏膜的T－SOD活性，降低黏膜的MDA含量，增強總抗氧化能力，減少脂質過氧化反應。這提示益生菌能增加黏膜抗氧化能力的作用，保護腸道黏膜，維持腸道正常功能，從而促進動物健康生長。

腸道黏膜中IgG和SIgA可以加強腸道細胞吞噬作用，，是防御病菌在腸道黏膜黏附和定植的第一道防線［14－15］。益生菌可在腸道黏附定植，發揮特異性免疫作用活化相關淋巴組織，使SIgA生物合成增加，提高黏膜免疫功能［16］。Vinderola 等［17］用瑞士乳桿菌灌喂小白鼠發現，小腸中SIgA漿細胞量有所增加，提示益生菌能增強黏膜免疫功能。本試驗中，在不同營養水平日糧中添加益生菌，能提高21 d肉雞腸道黏膜中的IgG和42 d黏膜SIgA水平，這表明益生菌能增強肉雞的黏膜免疫功能，其作用機理可能是:益生菌及其分泌物可作為抗原發揮免疫佐劑作用，活化腸黏膜內的微皺褶細胞和派伊氏淋巴結，與腸道上皮細胞及黏膜固有層免疫細胞相互作用，誘導腸道局部免疫反應，從而增強機體的體液免疫能力，防止致病菌或毒素在體內造成損害［18－19］。

3.4 不同營養水平下日糧中添加益生菌對腸道菌群的影響

腸道消化系統對營養物質的消化、吸收能力部分依賴于腸道中微生物分布的種類和數量。腸道中微生物的種類和數量決定了營養物質的代謝范圍和程度，它們與宿主的健康、疾病有著極其密切的聯系。當腸道微生態系統受到環境變化、采食、應激等因素的影響，其有益菌衍生的有益作用不能滿足動物的生長要求，導致腸道功能發生紊亂，引起疾病的發生。而添加益生菌能有效調節腸道微生物區系的種類，促進腸道有益菌增殖，同時可與有害微生物進行競爭，維持和調整腸道微生態平衡［20－21］。孫瑞鋒等［22］研究表明，添加枯草芽孢桿菌可降低21 d大腸桿菌和沙門氏菌的數量，增加乳酸桿菌數量，從而調節肉雞腸道微生態環境。本試驗中，在不同營養水平日糧中添加益生菌能極顯著提高21 d肉雞回腸的乳酸桿菌數量，降低21 d、42 d回腸大腸桿菌數量，但日糧營養水平則對腸道菌群影響不大，這提示益生菌在低營養水平日糧中也能發揮其抑制病原微生物、促進有益菌增殖的作用，其可能機制是:益生菌與腸道有益菌協同，通過有氧發酵，維持腸道的厭氧環境，從而排斥有害菌;益生菌在代謝過程中產生一些抗菌物質，能直接殺滅致病菌［23］;益生菌能清除腸道內的毒性胺、硫化物、酚類和吲哚等，減少有害菌的代謝底物。但益生菌抑制有害菌、促進有益菌增殖的具體作用機理及其與機體有益菌的協同效應尚需更深入的探究。

4 結論

4.1 益生菌在不同營養水平下均能改善肉雞的免疫功能和抗氧化性能，促進有益菌的增殖。

4.2 在低營養水平下添加益生菌能促進肉雞前期的免疫器官生長和發育，促進腸黏膜免疫球蛋白分泌，極顯著促進21 d回腸乳酸桿菌的增殖，抑制大腸桿菌增殖。

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