8種油茶蒲提取物中活性物質含量及其抗氧化能力的比較研究

李利敏 沈建福 吳曉琴

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，杭州 310058)

油茶(Camellia oleifera Abel)是我國特有的木本油料樹種，也是世界四大食用木本油料樹種之一，山茶油被稱為“東方橄欖油”。油茶在中國南方各省分布廣泛，以湖南、江西、廣西、浙江和湖北等省栽種面積最大，國外在日本、緬甸、越南等國家也有少量分布。我國的油茶栽培物種，按照花的色澤可分為白花油茶、紅花油茶和黃花油茶3大類;其中尤以白花油茶類(普通油茶)栽培歷史最久、分布面積最廣［1］。

油茶蒲又稱茶包，為油茶果的外殼，占油茶果鮮質量的60% ～70%，是油茶生產過程中的廢棄物，每年產生的油茶蒲有近百萬噸之多［2］，常被丟棄或作為燃料，利用率極低。長時間來國內外對于油茶蒲利用研究主要集中于茶皂素提取［3］與活性碳制備［4］，隨著對油茶蒲研究的不斷深入，人們發現其具有很強的生物活性，例如油茶蒲多糖具有極強抗氧化作用、抗癌活性［5］;油茶蒲醇提物對脂肪酸合酶(FAS)有極強抑制作用，使其成為潛在的減肥降脂功能因子［6］;陳秋平等［7］首次在普通油茶茶蒲醇提物中分離鑒定出3－O－甲基鞣花酸－4'－O－β－D－吡喃葡萄糖(MEAG)，通過細胞試驗發現，MEAG具有極強的促進成熟脂肪細胞內脂肪分解作用，可能是油茶蒲提取物減肥降脂的關鍵化合物之一。油茶蒲提取物對5α－還原酶也有較強抑制作用，能明顯改善丙酸睪酮導致的大鼠良性前列腺增生癥狀［8］。

國內外大多數研究往往局限于一個品種，由于不同油茶品種之間差異性比較顯著，油茶蒲提取物中活性物質的含量及其生物活性亦具有一定的差異。本研究選擇常見的8種油茶品種(浙江紅花油茶、小果油茶、攸縣油茶、大果紅花油茶、博白大果油茶及仙居、三江、常山普通油茶)，研究比較油茶蒲提取物中活性物質含量及其抗氧化活性，為更好的開發和利用油茶蒲提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

浙江紅花油茶(Camellia chekiangoleosa Hu):浙江省衢州市常山縣;普通油茶(Camellia oleifera A-bel):浙江省仙居縣、三江縣、常山縣;小果油茶(Camellia meiocarpa Hu):廣西壯族自治區三江侗族自治縣;攸縣油茶(Camellia yuhsienensis Hu):采湖南省株洲市攸縣;大果紅花油茶(Camellia semiserrata Chi):廣西梧州藤縣;博白大果油茶(Camellia gigantocarpa Hu):廣西省玉林市博白縣。

1.2 儀器與試劑

RE－52AA旋轉蒸發器:上海亞榮生化儀器廠;SHB－III循環水式多用真空泵:上海豫康科教儀器設備有限公司;TU－1810紫外－可見分光光度計:北京普析通用儀器有限責任公司;Alliance 2695高效液相色譜儀、2996紫外檢測器:美國Waters公司。

人參皂素Re(純度＞98%):上海融禾醫藥技術發展有限公司;焦性沒食子酸(純度＞98.5%):國藥集團化學試劑有限公司;蘆丁標準品(純度＞95%)、2，2－二苯基 －1－苦基肼(DPPH):美國 Sigma公司;Folin－Ciocalteu試劑:北京鼎國生物技術有限責任公司;乙腈(色譜純)、乙酸(色譜純):美國Merk公司;鞣花酸標準品(純度97%):比利時Acros公司;沒食子酸標準品(純度＞99%)、2，4，6－三吡啶基三嗪(TPTZ):上海阿拉丁試劑有限公司;3－O－甲基鞣花酸－4'－O－β－D－吡喃葡萄糖(MEAG)標準品(純度＞95%):實驗室自制;其他試劑均為國產分析純。

1.3 油茶蒲醇提物制備

將新鮮油茶果外殼曬干，去除霉變、蟲害后粉碎，過60目篩，按照1∶10料液比加入50%乙醇(體積分數)溶液，熱回流提取1 h，過濾后減壓濃縮至干粉，得到油茶蒲提取物(oiltea camellia extracts，OCE)。測定時將此油茶蒲提取物用50%乙醇溶液超聲溶解，作為待測樣品液。

1.4 8種油茶蒲提取物中活性物質含量測定

1.4.1 多糖含量標準曲線測定

葡萄糖標準曲線測定:采用苯酚－濃硫酸法，精密吸取標準葡萄糖貯備液(0.098 mg/mL)0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL，各以蒸餾水補充至 2.0 mL，然后加入1.0 mL 5%苯酚溶液混勻后迅速加入濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，混勻后于室溫下放置20 min，以蒸餾水作為空白對照，在490 nm處測定吸光度。以葡萄糖標準溶液質量濃度為橫坐標(X，mg/mL)，以吸光值為縱坐標(Y)繪制標準曲線，測定回歸方程為Y=56.906X+0.014 4，R2=0.997 2。

1.4.2 黃酮含量標準曲線測定

蘆丁標準曲線測定:采用紫外直接測定法［9］，精密吸取蘆丁貯備液(1.044 mg/mL)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于10 mL 具塞試管中，用 50%乙醇(體積分數)定容至刻度，搖勻，靜置10 min后，以試劑空白為參照，于360 nm處測定吸光值。以蘆丁標準溶液質量濃度為橫坐標(X，mg/mL)，以吸光值為縱坐標(Y，A360)繪制標準曲線，測定回歸方程為Y=28.843X+0.018 7，R2=0.997 4。

1.4.3 皂苷含量標準曲線測定

人參皂苷標準曲線測定:精密吸取人參皂苷Re標準溶液(1.0 mg/mL)50、100、150、200、250 μL，氮氣吹干溶劑，分別加入0.2 mL 5%香草醛－冰醋酸，0.8 mL高氯酸，搖勻，60℃水浴15 min，取出放置冰水中冷卻，加入5 mL冰乙酸稀釋，在548 nm波長處測定吸光值，同時以試劑空白做參照。以人參皂苷含量為橫坐標(X，μg)，以吸光值為縱坐標(Y，A548)繪制標準曲線，回歸方程為Y=0.002 2X－0.021 3，R2=0.994 4。

1.4.4 多酚含量標準曲線測定

沒食子酸標準曲線測定:精密吸取沒食子酸標準溶液(0.1 mg/mL)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL Folin－Ciocalteu試劑，加入2 mL 15%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至10 mL，充分混合后，室溫放置1 h，于760 nm波長下測定吸光值，以沒食子酸質量為橫坐標(X，mg)，吸光值為縱坐標(Y)繪制標準曲線，回歸方程為Y=13.437X+0.035 7，R2=0.998 4。

1.4.5 樣品測定

吸取一定量油茶蒲提取液，按照上述標準曲線測定方法，分別測定油茶蒲提取物中多糖、黃酮、皂苷及多酚含量。

1.5 油茶蒲提取物抗氧化活性測定

1.5.1 DPPH自由基清除率測定

測定方法在Zhou等［10］方法上稍作修改，將1.0 mg/mL油茶蒲提取物用50%乙醇溶液稀釋成不同濃度梯度(25.0、20.0、15.0、10.0 和 5.0 μg/mL)，各取1.0 mL上述樣品液于試管中，再加入3.0 mL質量濃度為0.04 g/L DPPH溶液，混合均勻，室溫避光反應30 min后在517 nm處測定吸光值，以抗壞血酸為對照，清除率按照下面公式計算:

清除率 =［1－(Ai－Aj)/A0］×100%

式中:A0為未加樣品時DPPH溶液的吸光值;Ai為加入樣品后溶液的吸光值;Aj為樣品溶液的吸光值。

1.5.2 總抗氧化能力測定

總抗氧化能力測定采用FRAP方法。參照Zou等［11］的方法，將 1.0 mg/mL油茶蒲提取物用 50%乙醇溶液稀釋成不同濃度梯度(30.0、25.0、20.0、15.0 和10.0 μg/mL)，取 1.0 mL 樣品溶液加入到3.0 mL 工作液中(10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L FeCl3、0.3 mol/L 醋酸緩沖液以 1∶1∶10 比例混合，預熱至37℃備用)，搖勻后于37℃水浴中靜置10 min，593 nm波長處測定其吸光值。另以 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mmol/L FeSO4測定繪制標準曲線，樣品的抗氧化活性以達到同樣吸光度值所需的FeSO4毫摩爾數表示。

1.6 HPLC測定油茶蒲提取物多酚類物質特征化合物

1.6.1 檢測色譜條件

色譜柱:Luna C18(250 mm ×4.60 mm，5 μm);柱溫:25℃;進樣量:10 μL;流速:1.0 mL/min;檢測波長254 nm;流動相A:乙腈;流動相B:1%乙酸水溶液;梯度洗脫:0～8 min，5%～10%A;8～16 min，10%A;16～25 min，10%～15%A;25～30 min，15%A;30～35 min，15%～20%A;35～40 min，20%A;40～45 min，20%～5%A;45～50 min，5%A。

1.6.2 標準曲線測定

精密吸取沒食子酸標準貯備液(21.6μg/mL)0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00 mL 于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度;精密吸取鞣花酸標準貯備液(22.3 μg/mL)0.2、0.4、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用二甲基亞砜定容至刻度;精密吸取 MEAG標準貯備液(22.6 μg/mL)0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

將上述不同質量濃度標準品溶液搖勻過0.45 μm濾膜后按照1.6.1項色譜條件進樣檢測。以標準品質量濃度為橫坐標(X，μg/mL)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。沒食子酸標準曲線為Y=19 695X －51 865，R2=0.999 8;鞣花酸標準曲線為Y=78 126X －211 683，R2=0.999 4;MEAG 標準曲線為 Y=44 636X －20 345，R2=0.999 9。

1.6.3 樣品液測定

取已經制備好的油茶蒲提取液，過0.45μm濾膜后按照1.6.1項色譜條件進樣檢測。然后根據峰面積，從1.6.2項標準曲線上計算出特征物質含量。

2 結果與分析

2.1 8種油茶蒲提取物中活性物質含量測定

根據樣品吸光度值，由標準曲線計算出8種油茶蒲提取物中活性物質含量。從圖1可知，各個品種油茶蒲提取物多糖含量都比較高，不同品種油茶蒲提取物多糖含量之間存在一定差異性，攸縣油茶茶蒲提取物多糖含量最高，浙江紅花油茶茶蒲提取物多糖含量最低;由圖2可知，浙江紅花油茶茶蒲提取物黃酮含量顯著高于其他品種，博白大果油茶茶蒲提取物黃酮含量最低;由圖3可知，相比與其他活性物質，油茶蒲提取物中皂苷含量最高，其中又以小果油茶和博白大果油茶茶蒲提取物皂苷含量最高，其他品種之間皂苷含量差別不是很大，現今，主要從壓榨完的油茶籽餅粕中提取茶皂素，結果表明，油茶蒲皂苷含量也非常高，為一種較好的茶皂素提取原料;由圖4為可知，仙居普通油茶和常山普通油茶茶蒲提取物多酚含量高于其他品種，大果紅花油茶茶蒲提取物中多酚含量最低。

2.2 8種油茶蒲提取物抗氧化活性比較

2.2.1 DPPH 法測定結果

DPPH乙醇溶液呈紫色，是一種穩定的自由基，在波長517 nm處有強吸收。當溶液中存在有供氫能力的抗氧化劑時(如酚類)，其可與DPPH單電子配對，將溶液還原為淺黃色，吸光度變小，且其褪色程度與接受電子的數量呈正比，該方法被廣泛用于評價植物提取物的體外抗氧化活性。

本試驗測定了8種油茶蒲提取物對DPPH自由基清除能力，以抗壞血酸(VC)為陽性對照。由表1與圖5可知8種油茶蒲提取物具有明顯的清除DPPH自由基活性，且在一定范圍內呈量效關系;其中仙居普通油茶茶蒲提取物清除能力最強，半抑制濃度僅為22.07μg/mL，其次為常山普通油茶;浙江紅花油茶和大果紅花油茶茶蒲提取物清除能力比較弱，整體來看普通油茶茶蒲提取物DPPH清除能力明顯高于其他品種。

表1 八種油茶蒲提取物清除DPPH自由基半抑制濃度(IC50)

圖5 油茶蒲提取物對DPPH清除作用

2.2.2 總抗氧化能力測定結果

FRAP工作原理如下:TPTZ中的Fe3+可被樣品中還原物質還原為Fe2+，呈現出明顯的藍色，并于593 nm處具有最大吸收峰，由吸光度大小可計算樣品抗氧化活性。以FeSO4濃度為橫坐標(X，mmol/L)，吸光度為縱坐標(Y)，回歸方程為Y=4.692 9X+0.015，R2=0.996 3。

FRAP值以測定樣品液達到相同吸光度所需FeSO4毫摩爾數來表示，FRAP值越大，總抗氧化能力越強。由圖6可知隨著油茶蒲提取物濃度升高，FRAP值越大，總抗氧化能力越強，不同品種油茶蒲提取物抗氧能力依次為:仙居普通油茶＞常山普通油茶＞三江普通油茶＞攸縣油茶＞小果油茶＞博白大果油茶＞大果油茶＞浙江紅花油茶。在25μg/mL試樣濃度下，抗壞血酸 FeSO4濃度為 0.338 2 mmol/L，仙居普通油茶茶蒲提取物總抗氧化能力最強，FeSO4濃度為0.187 2 mmol/L;浙江紅花油茶和大果紅花油茶茶蒲提取物總抗氧化能力最弱，FeSO4濃度分別為 0.066 8 mmol/L 和 0.069 7 mmol/L。總抗氧化能力測定結果和DPPH清除測定結果相似，普通油茶茶蒲提取物總抗氧化能力強于其他品種提取物。

圖6 油茶蒲提取物總抗氧化能力測定

2.2.3 8種油茶蒲提取物活性物質與其抗氧化活性之間的相關性

DPPH法和FRAP法2種方法用來測定油茶蒲提取物抗氧化活性，DPPH方法是基于對DPPH自由基的清除作用來反映被測樣品的抗氧化活性，半抑制濃度越低抗氧化活性越高;FRAP方法是基于體系中還原劑與三價鐵離子的氧化還原反應，FRAP值(FeSO4當量)越大，被測樣品抗氧化活性越強。由表2可知，油茶蒲提取物多酚物質與其抗氧化活性之間相關性最高，與FRAP值的相關性甚至達到了0.9;其次為多糖類物質，與DPPH清除率相關性為－0.829。據此，初步推測，油茶蒲提取物中多酚及多糖為其主要抗氧化物質，這兩者含量越高，油茶蒲提取物抗氧化活性越強，測定結果與國內外文獻報道［5，13，16］中油茶蒲多酚與多糖具有較強的抗氧化活性相一致。

表2 油茶蒲活性物質含量與其抗氧化活性之間的相關性

2.3 HPLC法分析測定8種油茶蒲提取物酚類物質特征化合物

多酚類物質例如槲皮素、蘆丁、兒茶素、咖啡酸、沒食子酸、綠原酸等具有較強的抗氧化活性［13］，運用反相－HPLC進一步分析測定油茶蒲多酚類物質成分及含量。參照文獻［7］及對照標準品保留時間和最大吸收波長，確定沒食子酸、MEAG及鞣花酸為油茶蒲酚類物質主要特征化合物，按照峰面積歸一法測定這3種特征化合物含量。由圖7與表3可知，不同品種油茶蒲提取物多酚類物質組成及含量差別較大，博白大果油茶茶蒲提取物中不含有這3種特征化合物，因其皂苷含量較高，分析圖中特征峰物質可能為皂苷類，需要進一步分離鑒定;普通油茶茶蒲提取物中3種物質均含有，且以仙居普通油茶茶蒲含量最高，浙江紅花油茶茶蒲提取物中沒食子酸含量遠遠高于其他品種，而大果紅花油茶茶蒲提取物中MEAG含量遠遠高于其他品種，因此可以利用大果紅花油茶茶蒲提取物分離制備MEAG單體。除了這3種特征化合物外，由圖7可知，還有很多特征峰物質組成成分并不明確，例如，浙江紅花油茶在11 min左右出現的峰值，需要進一步分離鑒定，測定其生物活性。

表3 8種油茶蒲提取物酚類物質特征化合物含量測定

圖7 不同品種油茶茶蒲提取物HPLC圖

3 討論與結論

油茶蒲是油茶加工過程中的副產物，含有大量木質素、多縮戊糖、皂素等化學成分［12］，其較強的抗氧化、抗癌、調節血脂等生物活性逐漸被人們認識發現，但對于其活性物質含量測定鮮有報道，本試驗確定了測定油茶蒲提取物活性物質含量通用方法，測定結果表明油茶蒲提取物中皂苷類物質含量最高，其次為多糖類及酚類物質。

采用DPPH自由基清除法和總抗氧化能力法測定了油茶蒲提取物抗氧化能力，發現其具有較強的抗氧化活性，多酚類物質與抗氧化活性呈顯著相關性(DPPH 清除，R2= －0.780;FRAP值，R2=0.911)，此測定結果與國內外文獻報道呈一致性，例如，Zhang等［13］測定了產自廣西、江西、湖南、浙江及安徽5個區域普通油茶茶蒲提取物總酚含量及抗氧化能力，結果表明廣西地區茶蒲提取物總酚含量最高(沒食子酸當量=234.90 mg/g)，抗氧化能力最強(DPPH清除IC50=899.25μg/mL，總抗氧化能力抗壞血酸當量=12.91 mg/g)，并且總酚含量與抗氧化能力之間存在顯著相關性;Laura等［14］分析發現墨西哥山核桃皮提取物與其抗氧化活性之間有極顯著地正相關性(ORAC，R2=0.945;DPPH，R2=0.999)，ORAC及DPPH清除作用與山核桃提取物中沒食子酸含量呈正相關，與鞣花酸呈負相關，HO清除作用只與鞣花酸含量呈正相關，其他鞣酸物質含量呈負相關;楊冬梅等［15］分析了12種常見蔬菜多酚含量與其抗氧化之間關系，發現所有蔬菜抗氧化活性與多酚含量之間均有一定的相關性，FRAP值與多酚類物質之間的相關性最高(R2=0.808 6)。

通過分析活性物質含量與抗氧化活性之間相關性，發現油茶蒲多糖類物質與抗氧化活性之間也存在較為顯著地相關性(DPPH清除，R2=－0.829)。Jin［5］將油茶蒲粗多糖經DEAE纖維柱層析和Sephadex G－200層析柱得到油茶蒲多糖(WEP2)，運用HPLC分析發現WEP2由鼠李糖、海藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成，WEP2具有較強抗氧化活性，當質量濃度為1.0 mg/mL時，對羥基自由基和超氧陰離子自由基清除率分別達到72.5%和86.3%，強于同等濃度的抗壞血酸。

因此，初步推斷油茶蒲提取物中多酚類物質與多糖類物質為其主要抗氧化物質。

Zhang等［13］運用HPLC分析測定了油茶蒲酚類物質組成，發現沒食子酸為其主要成分。本試驗采用HPLC法分析測定了不同品種油茶蒲提取物多酚類物質組成，發現不同品種之間酚類物質組成差別比較大，普通油茶和攸縣油茶茶蒲提取物中酚類物質以沒食子酸、MEAG和鞣花酸為主;而博白大果油茶茶蒲提取物中這3種都不含有，但是其清除DPPH能力和總抗氧化活性還比較強，因此一定還存其他酚酸類物質，需要進一步鑒定。通過系統研究不同品種油茶蒲提取物中活性物質及抗氧化活性，為有效地、針對性地利用油茶蒲資源提供了理論基礎。

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