四物口服液對羥基自由基的清除作用

胡大強，傅若秋，盧來春，宋宏宇，徐 靖，向明鳳

(中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院藥劑科，重慶 400042)

四物口服液是依據四物湯組方，采用現代制劑工藝生產的中成藥口服液。四物湯源自宋代《太平惠民和劑局方》，是補血養血、活血調經之經典方劑，由熟地黃、白芍、當歸、川芎4味中藥組方，當歸、熟地黃為君藥，臨床用于治療盆腔炎、腎炎、肩周炎等[1]。本研究中采用熒光分光光度法評價四物口服液體外對羥基自由基的清除作用，觀察到四物口服液具有體外清除致炎分子自由基的作用[2]，現報道如下。

1 儀器與試藥

ZF－I型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠);培養皿(外徑80 mm);BS124S型電子分析天平(Sartorious);F－2500型熒光分光光度計(Hitachi，Tokyo Japan)。苯甲酸(分析純，重慶川東化工有限公司，批號為20080812);30%過氧化氫(成都科龍化工試劑廠，批號為20110219);四物口服液(批號為100715)和純化水均由第三軍醫大學第三附屬醫院藥劑科提供。

2 方法與結果

2.1 樣品測定

取22mmol/L的過氧化氫溶液1.00mL，分別加入不同稀釋倍數的系列樣品溶液2.00 mL，置外徑80 mm培養皿中混勻，254 nm紫外光照射25min，分別加入0.80mol/L苯甲酸3.30mL混勻，室溫放置5min，在激發波長304 nm、發射波長401 nm條件下測定熒光強度。

2.2 熒光檢測條件的確定及試驗可行性分析

在外徑80 mm培養皿中加入22 mmol/L過氧化氫溶液1.00mL和純化水 2.00mL，在 254 nm 紫外光下照射 25min，加入 0.80mol/L苯甲酸 3.30mL，室溫放置 5min，即得試樣 1;在外徑80mm培養皿中加入純化水3.00mL，在254 nm紫外光下照射 25min，加入 0.80mol/L 苯甲酸 3.30mL，室溫放置 5min，即得試樣2;精密吸取四物口服液1.00mL置100 mL容量瓶中，加純化水至刻度定容，搖勻，精密吸取上述液2.00 mL置外徑80mm培養皿中，再加純化水1.00mL，搖勻，在254 nm紫外光下照射 25min，加入 0.80mol/L 苯甲酸 3.30mL，室溫放置 5min，即得試樣3。

固定測定熒光測定參數，分別對上述3種試樣進行熒光掃描，得熒光圖譜，見圖1。試樣1的最大激發波長為304 nm，最大發射波長為401 nm。在激發波長304 nm和發射波長401 nm處測定，試樣1有較高熒光強度，試樣2和試樣3則與基線接近。因此，選擇激發波長304 nm和發射波長401 nm作為熒光檢測波長用于四物口服液對羥基自由基的清除作用評價。

圖1 熒光發射光譜圖

2.3 苯甲酸溶液濃度的選擇

吸取1.00mL過氧化氫溶液(20mmol/L)置5個外徑80mm培養皿中，254 nm紫外光下照射25min，分別加入3.30mL不同濃度苯甲酸溶液并搖勻，放置5min后，測定熒光強度，結果見表1，熒光強度隨苯甲酸濃度增加而增加，濃度超過0.80mmol/L時，熒光強度趨于穩定。

表1 苯甲酸溶液濃度選擇

2.4 紫外光照射時間對羥基自由基產生的影響

吸取 3.30mL 苯甲酸溶液(0.80mmol/L)和 1.00mL 過氧化氫溶液(22mmol/L)置外徑80mm培養皿中，混勻，在254 nm紫外光下照射不同時間，測定熒光強度，結果見表2。由表2可知，照射25min后溶液熒光強度最大，再增加紫外光照射時間熒光強度無顯著變化。因此，選定紫外光照射時間為25min。

表2 紫外光照射時間對羥基自由基產生的影響

2.5 過氧化氫線性范圍的確定

吸取1.00 mL不同濃度過氧化氫溶液于5個外徑80 mm培養皿中，置254 nm紫外光下照射25 min，分別加入3.30 mL苯甲酸溶液(0.80 mmol/L)，室溫放置5 min，測定熒光強度，結果見表3。

表3 過氧化氫濃度的選擇

2.6 樣品測定結果

按2.1項測定四物口服液清除羥基自由基的 IC50(熒光強度降低50%時藥物濃度)為0.009 3倍原藥，結果見表4。

表4 四物口服液清除羥基自由基的能力

3 討論

基于不同濃度的四物口服液對羥基自由基的清除能力不同和苯甲酸的熒光強度極低，在測定四物口服液對羥基自由基清除率時，需向體系中加入不同稀釋倍數藥物，反應后溶液中剩余的羥基自由基量不等，向溶液中加入過量苯甲酸，保證溶液中羥基自由基與苯甲酸反應完全，檢測產物的熒光強度才能準確反映四物口服液清除羥基自由基的能力。

試驗觀察到 2.00 mL 20 mmol/L過氧化氫檢測體系，0.01～0.80mmol/L苯甲酸 3.30mL條件下，反應體系熒光強度隨苯甲酸濃度增加而增加，當濃度超過0.80mmol/L時，熒光強度不再變化。因為在超過3.30mL(0.80mmol/L)苯甲酸時，體系中羥基自由基的量已相對不足，苯甲酸不能都轉變為強熒光物質。

[1]李 瓊，李 萍，黃曉君.桃紅四物湯加減綜合治療實性痛經療效觀察[J].遼寧中醫雜志，2007，34(5):617 －618.

[2]趙淑杰，韓忠明，李彥穎，等.鹿藥提取物清除羥基自由基的研究[J].華南農業大學學報，2010，31(2):59－62.