細粒棘球蚴囊液蛋白質組學的分析研究

張 倩，李居怡，趙嘉慶，王亞娜，朱明星，趙 巍

細粒棘球蚴病(Echinococcosis)又稱包蟲病，是細粒棘球絳蟲的幼蟲(即棘球蚴)感染寄生所致的一種人畜共患性寄生蟲病［1-5］。該病嚴重危害人類健康和畜牧業生產，在我國主要流行于新疆、甘肅、青海、寧夏、內蒙古、西藏、陜西和四川西部等畜牧業地區［6-9］，目前已經證實我國有25個省區存在感染病例［10］。據調查顯示，2004—2008年全國包蟲病報告病例累計10 790例，涉及27個省，病例報告的范圍呈擴大趨勢，其中寧夏回族自治區共報告962例［11-13］。由于缺乏對棘球蚴的生長、發育以及其在人體內生長環境的深入研究和認識，目前包蟲病的防治效果并不理想，有關包蟲囊液營養代謝成分的研究報道多集中在家畜，如牛、羊等［14-15］，而關于人體肝包蟲囊液中蛋白成分研究鮮見報道。本研究擬運用蛋白質組學技術對細粒棘球蚴囊液的蛋白質成分進行初步研究，分析棘球蚴生長環境的蛋白質及構成情況，為深入了解細粒棘球絳蟲幼蟲的生長環境和所需營養物質、蛋白代謝途徑以及發育過程奠定基礎，亦為尋找有效控制手段提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 標本來源 取寧夏醫科大學附屬醫院肝膽外科為包蟲病患者實施手術后摘除的包囊。

1.2 儀器與試劑 MALDI-TOF質譜儀(Waters)、Bio-Rad電泳儀、Bio-Rad電泳槽、Bio-Rad凝膠掃描儀、Bio-Rad切膠儀、Power Dry LL3000凍干機(Thermo)、SmartSPECTM核酸蛋白微量分析儀(Bio-Rad)、高速冷凍離心機(日本HITACHI)、超聲波細胞破碎儀(昆山市超聲儀器有限公司)、－85℃超低溫冰箱(美國NuAire公司)、超純水儀(密理博貿易有限公司)、AE100電子天平(梅特勒－托利多)、320pH酸度計(梅特勒－托利多)、LQP-B-4顆粒制冰機(上海安亭科學儀器公司)、ES-135高壓滅菌鍋(日本TOMY公司)、可移動加樣器(天根生化科技(北京)有限公司)、超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)。

三氯醋酸 (TCA)、碘乙酰胺(Iodoacetamide)、胰蛋白酶(色譜純)、二硫蘇糖醇 (DTT)、CHAPS、PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)、碳酸氫銨、CHCA、TFA(三氟乙酸)，以上均購置于Sigma公司;礦物油(Mineral Oil)、Bio-Lyte 3/10、Ampholyte-40%等購于Bio-Rad公司;乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)、考馬斯亮藍G250、抑肽素 A、亮肽素(leupeptin)、SDS、溴酚藍(Bromophenol Blue)、Tris-base、Tris-HCl、尿素、甘氨酸、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、過硫酸銨(Ammonium Persulfate)、TEMED、乙腈(ACN)、B-巰基乙醇等購置 BBI公司，冰乙酸、甘油、NaOH、HCl、丙酮(acetone)、甲醇、異丙醇、95%酒精、磷酸等均為國產。

1.3 方法

1.3.1 提取囊液:無菌條件下分離包蟲單個小泡囊，抽取混合囊液，離心后沉淀為原頭蚴、上清為原始囊液，于－80℃冰箱冷凍保存備用。

1.3.2 細粒棘球蚴囊液蛋白質提取:從－80℃冰箱取出冷凍保存的原始囊液樣本，經室溫融化，不經任何處理。取5 ml囊液于凍干機中凍干成粉末，加入適量上樣緩沖液，置沸水中加熱5 min，混勻后即為SDS-PAGE樣品。分別利用直接裂解法、TCA-丙酮沉淀法［16］、Ready PrepTM2-D Cleanup Kit(除鹽)、AurumTMSerum Protein Mini Kit(除高峰度蛋白)，蛋白濃度測定均采用Bradford法［17］處理提取物。

1.3.3 雙向電泳:蛋白樣品在經過第一向等電聚焦電泳(7 cm、17 cm 的膠條，pH 3～10、pH 7～10)和第二向SDS-PAGE后，放入考馬斯亮藍溶液染色。

1.3.4 圖像采集和分析:根據等電點和分子量不同在凝膠上將蛋白分離。采用GS-800 Calibrated Densitometer投射掃描，用 PDQuest 8.0 2D Analysis Software進行分析。

1.3.5 肽指紋圖譜(PMF)的獲取:取樣品酶解液0.5 μl與基質 0.5 μl(CHCA 5 mg/ml加 45%乙腈，45%甲醇加0.1%TFA)混勻，點在上樣板上。設置MALDI-TOF-MS程序，在反射模式，電壓2000 V，肽質量片段m/z在800～3000 Da范圍內進行分析，獲得PMF。

1.3.6 蛋白質PMF檢索及蛋白質鑒定:應用最新公布的蛋白質數據庫SWISSPROT進行檢索，查詢結果以分數顯示。分數大于閾值時即表示檢索結果可信(P＜0.05)，否則檢索結果不可信。

2 結果

2.1 細粒棘球蚴囊液蛋白的SDS-PAGE電泳結果SDS-PAGE電泳顯示蛋白質主要分布在43.0～97.4 kD與14.4 kD，這2處蛋白高度表達，各類蛋白表達水平差異較大。這給后期的雙向電泳的分離帶來很大困難，會導致水平條紋的產生(見圖1)。

2.2 細粒棘球蚴囊液二維電泳圖譜的處理 囊液二維電泳圖譜經 PDQuest 8.0 2D Analysis Software分析后，大概能捕捉到30個蛋白斑點(見圖2)，大部分蛋白分布在43.0 ～97.4 kD，而14.4 kD 處蛋白丟失較多，蛋白的等電點分布在PI 5～9之間。

圖1 細粒棘球蚴囊液蛋白的SDS-PAGE電泳

圖2 細粒棘球蚴囊液蛋白質二維電泳圖譜

2.3 細粒棘球蚴囊液中各種蛋白質的PMF的獲取全自動凝膠切膠儀將圖2上PDQuest 8.0 2D A-nalysis Software捕捉到的蛋白斑點切下，膠內酶解后MALDI-TOF-MS得到PMF，酶解后30種蛋白，通過質譜獲取了21種蛋白，列舉蛋白PMF見圖3、4。

圖3 細粒棘球蚴囊液蛋白質No.3蛋白肽指紋圖譜

圖4 細粒棘球蚴囊液蛋白質No.12肽指紋圖譜

2.4 細粒棘球蚴囊液中各種蛋白質PMF的生物信息學分析 通過MASCOT軟件將各蛋白的PMF文件上傳到SWISSPROT數據庫進行比對，發現No.3、12、16、18檢索分數 ＞閾值70分，結果可信(P＜0.05)(圖 5、6)，而 No.1檢索分數為 27分(P ＞0.05)，其他蛋白PMF檢索結果評分較低，結果不可靠。從表1的鑒定結果來看，No.3為人 β-血紅蛋白;No.12、18為人白蛋白;No.16為人血清鐵傳遞蛋白。因細粒棘球絳蟲基因組序列目前還未知，相關的蛋白數據庫目前還不完善，所以囊液里面的其他蛋白斑點未能得到有效的鑒定。

圖5 細粒棘球蚴囊液蛋白質No.3匹配結果

圖6 細粒棘球蚴囊液蛋白質No.16匹配結果

表1 細粒棘球蚴囊液蛋白質肽指紋圖譜MASCOT檢索鑒定結果

3 討論

蛋白質組學主要是通過雙向電泳技術分離生物樣品中的蛋白質，進而通過質譜獲取每種蛋白的PMF，最終利用生物信息學分析工具將每種蛋白的PMF與已有的蛋白數據庫數據進行檢索比對，根據MASCOT評分結果對蛋白質結構、功能進行預測［18］。蛋白質組學技術是全面、有效、快速、可信的研究手段，利用它分析囊液的蛋白構成是準確的，并且可以結合生物信息學技術做很好的對比分析。通過各種條件的比較發現采用17 cm、PH 7～10的膠條，上樣量為200 μg，TCA-丙酮沉淀法，能夠使囊液中的蛋白在二維電泳圖譜上得到更有效的分離，蛋白斑點較多、更清晰，但缺陷是有些偏酸性蛋白可能就丟失了;而除高豐度蛋白的方法不利于囊液二維電泳圖譜的建立。趙慰先等發現人體棘球蚴囊液中幾乎為白蛋白和球蛋白，而其他蛋白含量非常少，其中44%為白蛋白，α-球蛋白及β-球蛋白占39%，而17%為γ-球蛋白，且囊液中的蛋白質具有抗原性［19］。本實驗將細粒棘球蚴囊液中的蛋白根據不同的分子量及等電點采用雙向電泳進行有效分離，發現囊液中約有30種蛋白，集中在43.0～97.4 kD與14.4 kD，PI在5～9之間。揭示囊液中主要是以白蛋白和球蛋白為主，其他蛋白種類和含量均很少。

經過MALDI-TOF-MS對囊液凝膠上每個酶解后的蛋白進行處理，獲取了21種蛋白的PMF，而其余9個斑點未能成功獲取，其原因可能是:①PDQuest 8.0 2D Analysis Software 分辨率較高，對于非常微量的蛋白，經切膠酶解后打質譜，因未達到質譜要求濃度級別而未獲取;②比較微量的蛋白在酶解時因其含量的損失達不到質譜要求濃度未獲取。

目前有關蛋白質的數據庫較多，其中SWISSPROT數據庫是規模最大、數據最全的，根據酶解方法選擇相應的搜索選項，將獲取的蛋白PMF與數據庫中已知的數據進行比對，根據評分結果的高低，可對未知蛋白做大致的定性分析。Coltorti等［20］研究發現細粒棘球蚴囊液中的白蛋白、球蛋白來自于宿主組織，它是通過擴散的方式進入包蟲囊中，并不是通過主動吸收過程，因為血清中的蛋白是囊液中的1000～10000倍。本研究根據MASCOT評分結果初步鑒定出囊液中含有血清鐵傳遞蛋白、白蛋白、β-血紅蛋白3種，其他蛋白因評分很低，結果不可信。通過生物信息學手段分析血清鐵傳遞蛋白、白蛋白、β-血紅蛋白均來自于人體本身。推測3種蛋白在棘球蚴生長發育過程中可能發揮以下作用:①人血清鐵傳遞蛋白可能是為運輸原頭蚴生長所需要的鐵而發揮作用;②人體白蛋白可能為原頭蚴生活提供必要的能源物質;③人血紅蛋白可能是為細粒棘球蚴原頭蚴運輸氧氣和二氧化碳，以維持囊液的酸堿平衡。

綜上所述，本實驗初步建立了細粒棘球蚴囊液雙向電泳圖譜，為后期研究細粒棘球蚴囊液的蛋白質組成提供基礎數據和比對圖譜，而囊液里面的其他蛋白未得到有效鑒定，還需進一步深入研究。

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