鬼臼毒素衍生物Lg-2對人肝癌細胞系HepG-2凋亡的誘導作用

牛海峰，景鴻恩，惠 玲，閆 蔚，王 君，王宏賓，王曉臨，周 通，張國華，譚大勇

原發性肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，根據最新統計，全世界每年新發肝癌患者約60萬，肝癌居惡性腫瘤的第5位。除手術治療外，誘導腫瘤細胞凋亡是目前腫瘤治療研究的熱點，并有可能成為腫瘤治療的新途徑，因而尋找高效低毒的誘導腫瘤細胞凋亡的藥物非常重要。鬼臼毒素主要來源于小檗科的鬼臼屬、八角蓮屬和山荷葉屬等，具有顯著的細胞毒性和抗腫瘤作用，目前臨床應用較為廣泛的依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)均為半合成鬼臼毒素衍生物［1］，它們對小細胞肺癌、睪丸癌、急性白血病以及惡性淋巴腫瘤等均有良好的療效［2］。由于晚期腫瘤患者對現有鬼臼毒素衍生物普遍耐藥，同時該類藥物水溶性差、抗瘤譜窄、具有較嚴重的骨髓抑制，其應用逐漸受到限制，為克服VP-16和VM-26的不良反應，研究者對其進行了大量結構修飾工作［3-4］。N-(1-烴氧基-2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基氧羰基)-L丙氨酸-4'-去甲-4-脫氧鬼臼酯(Lg-2)為本課題組新合成的一種鬼臼毒素衍生物，是以丙氨酸作為Linker連接氮氧自由基生成一個新型的去甲表鬼臼酯化合物。前期研究表明，Lg-2有較好的抗腫瘤活性［5-6］。由于現有的鬼臼類衍生物對肝癌的抗腫瘤活性較差，本研究以肝癌HepG-2細胞為研究對象，研究Lg-2對HepG-2細胞的抗腫瘤效果，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 Lg-2由蘭州大學化學化工學院提供，相對分子量287.16，純度達95%以上，其結構式見圖1。DMSO配置成0.001 mol/L原液，置－20℃凍存備用。HepG-2肝癌細胞株由蘭州軍區總醫院醫學實驗科提供。RPMI 1640、DMSO、噻唑藍(MTT)均購自美國Sigma公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，Hoechst33258染色試劑盒購自碧云天公司，逆轉錄試劑盒為大連Takara公司產品。RT-PCR引物由大連寶生物工程有限公司合成:p53引物上游序列:5'-CGTGTGGAGTATTTGGATGACAGA-3'，下 游序 列:5'-TGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGA-3'。Bax引物上游序列:5'-GCCAGCAAACTGGTGCTCAA-3'，下游序列:5'-ATGTCCAGCCCATGATGGTTC-3'。Bc1-2引物上游序列:5'-TGTGTGTGGAGAGCGTCAACC-3'，下游序列:5'-TTCAGAGACAGCCAGGAGAAATC-3'。p21引物上游序列:5'-CAGGGGACAGCAGAGGAAGA-3'，下 游 序 列:5'-TTAGGGCTTCCTCTTGGAGAA-3'。Caspase3引物上游序列:5'-GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3'，下 游 序 列:5'-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG-3'。β-actin引物上游序列:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游序列:5'-GAAGATGGTGATGGGATTC-3'。

圖1 N-(1-烴氧基-2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基氧羰基)-L 丙氨酸-4'-去甲-4-脫氧鬼臼酯(Lg-2)結構式

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:HepG-2細胞培養于含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI 1640培養基中，置37℃、5%CO2培養箱常規培養，取對數生長期細胞進行試驗。

1.2.2 MTT法檢測Lg-2對HepG-2細胞體外增殖的抑制作用:分別設陰性對照組(只加HepG-2細胞)、VP-16處理組及Lg-2處理組3組。在96孔培養板內每孔接種6000個單細胞懸液100 μl培養過夜，次日分別加入終濃度為 0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L的VP-16(VP-16處理組)與Lg-2(Lg-2處理組)。另設調零孔(只加培養液)。每組3個復孔，繼續培養48 h;同上接種細胞于96孔板，加入終濃度為10 μmol/L的 VP-16及 Lg-2，分別培養12、24、36、48、60 h，在上述時間點吸去培養基，加入含5 mg/ml的 MTT 的培養基 100 μl，37℃ 孵育 4 h，棄上清，加入 150 μl的 DMSO，輕微震蕩 10 min，于490 nm波長處用酶標儀測定各孔吸光度值(A)，計算增殖抑制率。該實驗重復3遍，結果取平均值。增殖抑制率的計算公式為:

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期和腫瘤細胞凋亡:分別設陰性對照組(只加HepG-2細胞)、VP-16處理組及Lg-2處理組3組。接種HepG-2細胞于培養瓶，每瓶1×109個，貼壁后加入終濃度為10 μmol/L的VP-16(VP-16處理組)與Lg-2(Lg-2處理組)，陰性對照組加入等量RPMI 1640，分別培養24、48 h，胰酶消化收集細胞，離心5 min(800 r/min)，PBS洗一次，加入預冷的70%乙醇4℃固定1 h;離心5 min(800 r/min)，棄上清，1 ml PBS重懸細胞，400目篩網過濾，離心棄上清，加入50 μg/ml的PI染色液，混勻，4℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測。

1.2.4 Hoech33258染色檢測細胞凋亡:分別設陰性對照組(只加HepG-2細胞)及Lg-2處理組。取潔凈蓋玻片置于6孔板內，接種2×104個HepG-2細胞培養過夜，使細胞達到50% ～80%融合。加入終濃度為10 μmol/L的 Lg-2(Lg-2處理組)培養24 h，陰性對照組加入等量 RPMI 1640，取出蓋玻片，PBS洗2次，加入0.5 ml固定液固定，棄固定液，PBS洗2遍(可輕微震蕩)，每次 3 min，加入0.5 ml的 Hoechst33258 染色液，染色5 min，PBS 洗2遍，每次3 min。加抗熒光淬滅封片液于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 p53、bax、bc1-2、p21、Caspase3 基因轉錄水平的RT-PCR檢測:分組同“1.2.3”。①總 RNA 的提取:分別接種2×105個HepG-2細胞于培養瓶中，加入終濃度為10 μmol/L的VP-16(VP-16處理組)與Lg-2(Lg-2處理組)，陰性對照組加入等量 RPMI 1640，培養 48 h，胰酶消化后收集，按 Invitrogen TRIZOL Reagent說明書提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度和濃度并定量。②逆轉錄反應:參照Takara逆轉錄試劑盒說明書進行，總RNA 6 μl，DEPC 水 4.5 μl，Oligo(dT)3 μl，5 × buffer 5 μl，dNTP5 μl，逆轉錄酶 1 μl，RNase inhibitor 0.5 μl。反應條件為70℃保溫10 min，冰上2 min，42℃保溫1 h，70℃保溫15 min后冰上冷卻。③PCR:β-肌動蛋白(β-actin)作為內參，反應體系為 20 μl，其中cDNA 2 μl，上下游引物各 0.8 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2 × )10 μl，ROX Reference Dye(50 × )0.4 μl，ddH2O 6 μl。擴增條件為 95℃ 預變性 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，共進行40個循環。通過 qPCR檢測細胞樣品中的目的基因和內參基因的表達量，根據qPCR反應曲線得到各樣品目的基因和內參基因的Ct值，采用ΔΔCt的方法進行相對定量。

ΔΔCt=(待測樣本的目的基因的Ct平均值－待測樣本的內參基因的Ct平均值)－(對照樣本的目的基因的Ct平均值－對照樣本的內參基因的Ct平均值)。

基因的表達量用F=2－ΔΔCt來表示，內參基因Ct值及目的基因Ct值均取3次實驗的平均值。

1.3 統計學方法 應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 Lg-2對HepG-2細胞生長的抑制作用 MTT檢測結果顯示，Lg-2對HepG-2細胞增殖有明顯的抑制作用。藥物處理48 h，隨藥物濃度增加抑制效應增強，Lg-2處理組各濃度HepG-2抑制率均高于VP-16處理組(P＜0.05)，見表1。隨藥物作用時間的延長抑制效應增強，Lg-2處理組各作用時間HepG-2抑制率均高于VP-16處理組(P＜0.05)，見表2。

表1 不同濃度VP-16、Lg-2對HepG-2細胞抑制率比較(±s，%)

表1 不同濃度VP-16、Lg-2對HepG-2細胞抑制率比較(±s，%)

注:VP-16:依托泊苷，Lg-2:N-(1-烴氧基-2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基氧羰基)-L丙氨酸-4'-去甲-4-脫氧鬼臼酯;與VP-16處理組相同藥物濃度比較，aP＜0.05

藥物濃度(μmol/L)VP-16處理組(n=3)Lg-2處理組(n=3)0.001 11.533 ±1.401 17.867 ±1.795a 0.01 21.367 ±1.332 26.467 ±0.850a 0.1 23.367 ±1.172 29.700 ±1.453a 1 31.633 ±1.124 47.533 ±1.514a 10 41.033 ±1.430 55.100 ±2.663a

表2 VP-16、Lg-2不同作用時間對HepG-2抑制率的影響(±s，%)

表2 VP-16、Lg-2不同作用時間對HepG-2抑制率的影響(±s，%)

注:VP-16:依托泊苷，Lg-2:N-(1-烴氧基-2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基氧羰基)-L丙氨酸-4'-去甲-4-脫氧鬼臼酯;與VP-16處理組相同作用時間比較，aP＜0.05

作用時間(h)VP-16處理組(n=3)Lg-2處理組(n=3)12 25.431 ±0.994 33.932 ±1.854a 24 42.532 ±1.866 47.474 ±0.652a 36 50.801 ±1.478 58.034 ±1.223a 48 54.174 ±1.821 59.631 ±2.061a 60 66.000 ±1.413 72.572 ±2.956a

2.2 Lg-2對HepG-2細胞周期的影響 流式細胞儀檢測顯示，在24及48 h時，Lg-2處理組S期細胞所占比例與陰性對照組及VP-16處理組比較均明顯增加，而G2/M期細胞顯著減少，提示Lg-2可使細胞阻滯在G2/M期，見表3。

表3 Lg-2對HepG-2細胞周期分布的影響(%)

2.3 細胞凋亡的形態學變化 Hoechst33258染色顯示，Lg-2處理組細胞核呈現不同程度的早期凋亡特征，如染色質致密濃縮，胞核體積變小，形狀變為腎型核，或細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體，典型的呈梅花瓣狀;而陰性對照組細胞細胞核完整，染色質均勻，無凋亡特征。見圖2。

圖2 Hoechst33258檢測Lg-2對HepG-2細胞凋亡的影響

2.4 Lg-2對HepG-2細胞凋亡相關基因表達的影響 qRT-PCR檢測結果顯示，與VP-16處理組比較，Lg-2處理組Bc1-2 mRNA的表達顯著降低(P＜0.05)，而 p53、Bax、p21、Caspase-3 mRNA 的表達顯著增高(P＜0.05)，見表4。

表4 Lg-2對HepG-2細胞凋亡相關基因表達的影響

3 討論

鬼臼毒素類藥物如VP-16是細胞周期依賴性和特異性抗腫瘤藥物，主要通過作用于DNA拓撲異構酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ)使DNA斷鏈而產生抗腫瘤作用［7］。筆者所在課題組以鬼臼毒素為基礎，合成了一系列結構新穎且具有較好抗腫瘤活性的鬼臼毒素衍生物。其中Lg-2是以丙氨酸作為Linker連接氮氧自由基生成一個新型的去甲表鬼臼酯化合物，有文獻報道，該基團本身具有一定抗腫瘤作用，并可作為抗腫瘤藥物載體使其優先聚積在腫瘤組織中［8］。本研究結果顯示，Lg-2能夠有效抑制人肝癌細胞系HepG-2的增殖，MTT檢測結果顯示Lg-2對HepG-2的作用呈時間依賴及劑量依賴性。Lg-2處理的HepG-2細胞，應用流式細胞儀分析其周期變化，G2/M期細胞比例顯著減少，提示Lg-2可使細胞阻滯在G2/M期，這與VP-16引起細胞周期S期阻滯有所不同，提示Lg-2可能具有其他的作用靶點。qRT-PCR結果顯示，與VP-16處理組比較，Lg-2處理組 Bc1-2 mRNA的表達顯著降低，而 p53、Bax、p21、Caspase-3 mRNA的表達顯著增高。

細胞凋亡受多種凋亡相關基因調控［9］，目前研究較為深入的與腫瘤發生發展密切相關的凋亡相關基因主要有p53基因、Caspase基因、Bcl-2基因家族等。近年來的研究表明，許多抗癌藥物通過誘導凋亡基因(如p53、Bax等)的表達，以及影響凋亡抑制基因(如 Bcl-2)的表達，達到抑制腫瘤增殖的作用［10］。p53 基因是一種腫瘤抑制基因［11］，分為野生型(wtp53)和突變型(mtp53)兩種［12］。野生型 p53基因可抑制細胞的異常增殖，能在細胞發生DNA損傷時使細胞停滯于G1/S期，使細胞有足夠時間修復損傷的DNA，恢復正常狀態;若損傷的DNA無法修復，則野生型p53基因可啟動細胞凋亡機制。p53可以上調Bax的表達、下調Bc1-2的表達共同完成促進細胞凋亡的作用。Bcl-2基因是重要的抗細胞凋亡的調控因子，是Bcl基因家族的一個重要成員，是一種調控細胞死亡的“存活基因”［13］。Bcl-2可抑制細胞的程序性死亡，并提供了一個選擇性的生存優勢。Bc1-2蛋白具有離子通道和?？康鞍椎碾p重作用，主要定位于內質網、核膜、線粒體膜上，它可以嵌入到膜中，將Bcl-2固定在膜上。目前認為，Bcl-2抑制細胞凋亡的機制可能與凋亡促進基因Bax拮抗，抑制細胞色素C自線粒體釋放到胞質，阻止細胞色素C對Caspase蛋白酶激活有關。Bcl-2還能促進谷胱甘肽進入細胞核，從而改變核內的氧化還原反應，阻止Caspase蛋白酶的活動和其他核改變，抑制細胞凋亡發生［14］。p21基因是野生型p53基因的下游基因，在p21基因上游有2個p53蛋白特殊序列結合位點，分別位于2400和8000 bp處。大量研究報道顯示p21有促進細胞凋亡的作用，當DNA受到損傷時，p21通過p53依賴性途徑修復受損的DNA，當修復失敗時，p53則介導受損細胞凋亡［15］。因此p21基因通過p53依賴性途徑間接參與了細胞凋亡。本實驗發現，HepG-2細胞經Lg-2處理后，p53轉錄水平增加，Bc1-2基因表達降低，Bax基因表達增強，使得Bax/Bcl-2上調，誘導凋亡。此外，Lg-2激活p21的表達促進細胞凋亡。在細胞內所發生的與凋亡有關的一系列有序的級聯反應中，Caspase蛋白水解酶的激活是關鍵步驟，Caspase-3是Caspase家族成員中執行凋亡的關鍵酶之一，在各種類型的細胞中廣泛分布，處于凋亡有序級聯反應的下游，在細胞內以無活性的前體(酶原)形式存在，被細胞外凋亡信號激活后，負責對全部或部分關鍵性蛋白的酶切(激活或滅活)，導致細胞凋亡［16］。本實驗發現，用HepG-2細胞經 Lg-2后 Caspase-3 mRNA的水平上升，說明 Lg-2可能通過上調Caspase-3 mRNA水平來誘導腫瘤細胞凋亡［17］。

綜上所述，Lg-2可能通過使細胞周期阻滯在G2/M期抑制細胞增殖，并通過p53、p21、Caspase-3信號途徑誘導其凋亡達到抑制腫瘤生長的目的。本研究為開發新的肝癌輔助用藥提供了理論依據，將有利于指導相關臨床前研究的開展。

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