丹參化學成分及丹參提取物對脂多糖刺激大鼠肝臟枯否細胞內P38和NF-κB信號通路蛋白表達的影響

李俊杰，沈 敏，李 霄，岳樹強

枯否細胞(kupffer cell，KC)是肝內單核/巨噬細胞系統(tǒng)的主要成員，其生物功能具有兩面性，一方面能清除細菌及毒素發(fā)揮抗感染作用，另一方面通過釋放各種炎癥介質放大炎癥反應而造成組織損傷［1］。此外，KC還可影響肝細胞、星狀細胞、內皮細胞等肝內主要組成細胞的生物學功能。因此，KC在慢性炎性肝損傷過程中發(fā)揮重要的作用［2］。KC內的核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB) 和P38是介導內毒素等多種致炎因子所致肝損害的重要分子通路，而阻斷NF-κB和P38信號通路可抑制IL-1、TNF-α等促炎因子介導的炎癥正反饋環(huán)，減輕炎癥程度［3-4］。丹參是唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia Miltiorrhiza Bge.)的干燥根莖，為傳統(tǒng)活血化瘀中藥，具有抗缺氧、改善微循環(huán)、降血壓、抗心肌缺血等作用。目前研究表明，丹參對慢性肝損傷也有較好療效，但因丹參成分復雜，其具體機制尚不清楚。已有研究報道，丹參可增強KC的吞噬功能，降低其分泌功能。但丹參的化學成分對KC內P38和NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響未見報道。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活的大鼠肝臟KC為模型，觀察丹參各成分及丹參提取物對P38和NF-κB信號通路蛋白表達的影響，為臨床應用丹參治療慢性肝病提供理論支持和實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與主要試劑 SD大鼠購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心。LPS、吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)和SB239063均購自Sigma公司。鼠抗人NF-κB65、磷酸化 NF-κB65(p-NF-κB65)、NF-κB 抑制蛋白(inhibitory-κB，I κB)、P38 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，P38MAPK)、磷酸化P38MAPK(Phosphorylation mitogen activated protein kinase，p-P38MAPK)和c-fos等單克隆抗體以及羊抗小鼠HRP標記IgG均購自武漢博士德生物工程有限公司。丹參新醌乙(批號:070706)、丹參新酮(批號:070625)、丹參醇A(批號:070120)、丹參酮Ⅰ(批號:070315)、異丹參酮Ⅰ(批號:070315)、丹參新醌甲(批號:070605)、隱丹參酮(批號:030806)、丹參酮Ⅱ A(批號:040616)、丹參酚酸B(批號:060328)及丹參藥材均購自西安鴻生生物技術有限公司。

1.2 受試藥物的制備 精確稱取以上丹參成分及丹參藥材各1 g，加95%乙醇回流提取60 min，蒸干乙醇備用。分別取上述受試藥物用DMSO溶解制成1 mg/ml的儲備液。取0.1 ml儲備液加0.9 ml不含血清的 DMEM/F12培養(yǎng)液，混勻，即得100 μg/ml工作液。對照溶液為每 L培養(yǎng)液含DMSO 100 ml。各受試藥物臨用前在無菌條件下進行配制。

1.3 原代KC分離、培養(yǎng)與傳代 參照馮俊明等［5］介紹的方法。無菌切取SD大鼠肝臟，以0.05%的Ⅳ型膠原酶灌注肝臟，待肝臟變軟后剝離肝包膜并制成細胞懸液，過150目篩網(wǎng);收集細胞懸液以500 r/min的速度離心2 min，收集上清，再重復離心3次，每次取上清;將上清再以1500 r/min的速度離心3 min，棄沉淀;加 20 ml Hank's液，混勻后500 r/min的速度離心2 min，取上清，重復離心1次。將所獲上清以1500 r/min的速度離心3 min，取沉淀細胞，重復洗滌1次。沉淀細胞用含200 ml/L小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液以3000 r/min的速度離心洗滌2次，每次10 min。4 g/L臺盼藍拒染檢測細胞活力后，調整細胞密度為1×1011/L，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶內，置于37℃、50 ml/L CO2孵箱內培養(yǎng)，經(jīng)消化法反復傳代純化后用于試驗。

1.4 免疫印記法(Western blot)檢測KC內P38、NF-κB信號通路蛋白及c-fos蛋白 取傳3代以上的KC接種于25 cm2培養(yǎng)瓶。待細胞生長融合至60%～70%時，將其分為以下14組:對照組、LPS組、PDTC組、SB239063組、丹參新醌乙組、丹參新酮組、丹參醇A組、丹參酮Ⅰ組、異丹參酮Ⅰ組、丹參新醌甲組、隱丹參酮組、丹參酮ⅡA組、丹參酚酸B組和丹參提取物組。除對照組外，其余各組均加入60 ng/ml LPS作用12 h。培養(yǎng)結束后，除LPS組外，其余各組均棄除培養(yǎng)上清并按照上述分組分別加入相應的丹參成分或提取物100 μg/ml、PDTC 10 mmol/L和SB239063 10 mmol/L，再培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結束后，收集上述各組KC，用預冷的PBS洗滌2次;吸盡水分后加入RAPI組織細胞裂解液適量，用刮勺將蛋白收集至1.5 ml EP管內;4℃靜置30 min、離心、BCA定量后調整蛋白量30 μg/泳道，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，半干轉膜、封閉;4℃條件下分別與NF-κB65、p-NF-κB65、I κB、p-I κB、P38MAPK、p-P38MAPK、c-fos的單抗孵育(1∶500～1000)過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000)，化學發(fā)光、顯影、壓片，灰度掃描。以各組目的蛋白表達灰度值與陰性對照組目的蛋白表達灰度值的比值為最終結果。以β-肌動蛋白(β-actin)作為內參照物。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩樣本均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗，多樣本均數(shù)比較采用完全隨機設計方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 丹參化學成分及丹參提取物對KC內P38信號通路蛋白表達的影響 與LPS組比較，PDTC顯著下調 p-P38MAPK表達(P＜0.05)，而不下調P38MAPK;SB239063顯著下調P38MAPK表達(P＜0.05)，而不下調p-P38MAPK;丹參新醌乙、丹參酮ⅡA與丹參酚酸B對P38MAPK的表達無影響;所有丹參成分和丹參提取物均能不同程度下調p-P38MAPK的表達(P＜0.05)。見表1、圖1。

表1 丹參化學成分及丹參提取物對KC內P38信號通路蛋白表達的影響(±s)

表1 丹參化學成分及丹參提取物對KC內P38信號通路蛋白表達的影響(±s)

注:KC:枯否細胞，LPS:內毒素，PDTC:吡咯烷二硫代氨基甲酸，P38MAPK:P38絲裂原活化蛋白激酶，p-P38MAPK:磷酸化P38絲裂原活化蛋白激酶;－:未檢測到;與LPS組比較，aP＜0.05

組別P38MAPK p-P38MAPK陰性對照組1.00 ±0.00 1.00 ±0.00 LPS 組 1.68 ±0.04 1.33 ±0.01 PDTC 組 1.61 ±0.02 0.63 ±0.04a SB239063 組 0.71 ±0.01a 1.11 ±0.03丹參新醌乙組 1.75 ±0.01 0.57 ±0.01a丹參新酮組 0.64±0.01a －丹參醇A組 0.55±0.03a －丹參酮Ⅰ組 0.82±0.04a －異丹參酮Ⅰ組 0.29±0.01a －丹參新醌甲組 0.56±0.01a －隱丹參酮組 0.79±0.03a －丹參酮ⅡA組 1.48±0.04 －丹參酚酸 B 組 1.52 ±0.05 0.90 ±0.01a丹參提取物組 1.06 ±0.01a 0.93 ±0.03a

圖1 丹參化學成分及丹參提取物對枯否細胞內P38信號通路蛋白表達的影響

2.2 丹參化學成分及丹參提取物對KC內NF-κB信號通路蛋白表達的影響 與LPS組比較，PDTC和SB239063顯著上調 KC內NF-κB65和 IκB的表達，并下調p-NF-κB65蛋白的表達(P＜0.05);隱丹參酮對NF-κB65的表達無影響;丹參酮ⅡA與丹參酚酸B對NF-κB65表達無影響，但顯著上調IκB的表達;其余受試丹參成分和丹參提取物均顯著下調NF-κB65和 IκB 表達(P ＜0.05);所有受試丹參成分和丹參提取物均明顯下調p-NF-κB65蛋白表達(P ＜0.05)。見表2、圖2。

表2 丹參化學成分及丹參提取物對KC內NF-κB信號通路蛋白表達的影響(±s)

表2 丹參化學成分及丹參提取物對KC內NF-κB信號通路蛋白表達的影響(±s)

注:KC:枯否細胞，LPS:內毒素，PDTC:吡咯烷二硫代氨基甲酸，NF-κB65:核轉錄因子-κB65，I κB:核轉錄因子-κB 抑制蛋白，p-NF-κB65:磷酸化核轉錄因子-κBp65;－:未檢測到;與LPS組比較，aP＜0.05

組別 NF-κB65 IκB p-NF-κ 1.00 ±0.00 1.00 ±0.00 1.00 ±0.00 LPS 組 1.25 ±0.02 1.43 ±0.03 1.22 ±0.04 PDTC 組 1.78 ±0.11a 3.91 ±0.25a 0.10 ±0.00a SB239063 組 1.86 ±0.05a 3.16 ±0.09a 0.05 ±0.00a丹參新醌乙組 0.54±0.01a － 0.05±0.00a丹參新酮組 0.69±0.02a － －丹參醇A組 0.55±0.01a － －丹參酮Ⅰ組 0.55±0.01a － －異丹參酮Ⅰ組 0.43±0.01a － －丹參新醌甲組 0.62±0.03a － －隱丹參酮組 1.12±0.01 － －丹參酮ⅡA 組 1.48 ±0.07 4.99 ±0.13a 0.53 ±0.01a丹參酚酸 B 組 1.61 ±0.06 3.24 ±0.16a 0.21 ±0.02a丹參提取物組 0.53 ±0.01a 0.88 ±0.02a 0.04 ±0.00 B65陰性對照組a

圖2 丹參化學成分及丹參提取物對枯否細胞內核轉錄因子-κB信號通路蛋白表達的影響

2.3 丹參化學成分及丹參提取物對KC內c-fos信號通路蛋白表達的影響 與LPS組比較，SB239063顯著下調c-fos蛋白的表達(P＜0.05)，而PDTC對c-fos蛋白的表達無影響。受試丹參化學成分和丹參提取物均能不同程度下調c-fos蛋白的表達(P＜0.05)。見表3、圖3。

表3 丹參化學成分及丹參提取物對KC內c-fos信號通路蛋白表達的影響(±s)

表3 丹參化學成分及丹參提取物對KC內c-fos信號通路蛋白表達的影響(±s)

注:KC:枯否細胞，LPS:內毒素，PDTC:吡咯烷二硫代氨基甲酸;－:未檢測到;與LPS組比較，aP＜0.05;

組別 c-fos 組別c-fos陰性對照組 1.00±0.00 丹參酮Ⅰ組 －LPS組 1.30±0.03 異丹參酮Ⅰ組 －PDTC組 1.12±0.01 丹參新醌甲組 －SB239063組 0.68±0.02a 隱丹參酮組 －丹參新醌乙組 0.08±0.00a 丹參酮ⅡA組 0.79±0.03a丹參新酮組 － 丹參酚酸B組 0.30±0.01a丹參醇A組 － 丹參提取物組 0.04±0.00a

圖3 丹參化學成分及丹參提取物對枯否細胞內c-fos信號通路蛋白表達的影響

3 討論

3.1 丹參提取物及各化學成分對P38信號通路蛋白表達的影響 P38是介導炎癥反應的重要通路蛋白，激活的P38可促進許多炎性細胞因子的表達，參與應激條件下細胞炎癥反應和細胞凋亡過程［6］。活化的P38MAPK和NF-κB信號轉導通路是LPS介導的炎癥細胞因子如TNF-α、IL-6和IL-8等分泌的重要分子機制。Carl等［7］應用Northern blot分析發(fā)現(xiàn)，對細胞用SB203580進行預處理，可降低細胞中IL-1α mRNA水平的表達，而且這種抑制作用顯著減少單核細胞的TNF-α產量。這充分說明P38在LPS誘導TNF-α生成中的重要性。P38家族包含有P38α、P38β、P38γ 和 p38δ 4 種亞型，但只有 P38α和P38β能被SB203580所抑制。本研究采用一致劑量水平、平行操作方法研究了丹參提取物和丹參化學成分對LPS激活KC內P38通路蛋白表達的影響。結果顯示，丹參新醌乙、丹參酮ⅡA與丹參酚酸B對P38MAPK的表達無影響，但所有丹參成分和丹參提取物均能不同程度下調p-P38MAPK的表達，其抑制 P38信號通路蛋白作用強于 SB239063。SB239063對LPS激活的KC內p-P38MAPK無明顯抑制作用，而顯著抑制下游蛋白c-fos。c-fos在細胞生產調節(jié)和胞內信號傳遞分泌中具有極為重要的作用，藕聯(lián)細胞外信息與細胞內靶基因的轉錄［8］，抑制c-fos入核可使炎性細胞因子轉錄與蛋白合成受阻從而使炎癥減輕。丹參提取物和丹參化學成分明顯下調c-fos表達，作用強度與SB239063相似，但丹參酚酸B和丹參酮IIA要弱一些。

3.2 丹參提取物及各化學成分對NF-κB信號通路蛋白的影響 NF-κB是一類能與多種基因啟動子部位的B位點發(fā)生特異結合并促進轉錄的核蛋白，通過對許多重要的細胞因子、黏附分子和趨化因子表達的調控，從而參與機體的炎癥反應的調節(jié)［9］。大量的研究證實，NF-κB的過度活化是炎癥介質產生的關鍵環(huán)節(jié)［10］。因此，抑制 NF-κB的過度活化可減少炎癥介質的表達、釋放，減輕嚴重創(chuàng)傷后組織器官的病理性損害，有利于創(chuàng)傷組織的修復。以NF-κB通路為潛在的治療位點，尋找增強機體防御功能、遏制細胞因子過度產生的措施，可能在以后的臨床實踐中為解決失控性炎癥反應而采用丹參提供了理論依據(jù)。本研究表明，丹參提取物和丹參化學成分對LPS激活KC內NF-κB信號通路蛋白表達有差異性調控作用。丹參酮ⅡA和丹酸酚酸B上調亞單位 I κB 表達，下調 p-NF-κB65的表達，結果與PDTC相似。其余丹參成分和丹參提取物可下調NF-κB65、I κB 和 p-NF-κB65 的表達，調節(jié)炎性細胞因子相關蛋白和黏附分子的表達，影響細胞的狀態(tài)和功能［11］。

3.3 P38與NF-κB信號通路蛋白之間的調控關系本研究結果顯示，當用LPS激活KC后，細胞信號通路蛋白阻斷劑PDTC和SB239063上調NF-κB65和I κB表達，下 調p-NF-κB65表達，說明兩者抑制NF-κB通路的主要效應是阻斷亞單位p-NF-κB65。PDTC對p-P38MAPK表達有抑制作用，而SB239063對p-P38MAPK無明顯抑制作用，其主要作用是抑制下游蛋白c-fos。PDTC對KC內的c-fos卻無抑制作用，其主要抑制作用位點在 p-NF-κB65;SB239063和PDTC在P38和NF-κB兩信號通路蛋白中產生協(xié)同作用。

綜上所述，丹參可抑制LPS對KC的激活作用，限制KC介導的炎癥反應，其主要機制可能是下調P38MAPK-NF-κB65-c-fos通路蛋白的活性，但不同的丹參化學成分作用的靶分子不同。值得注意的是，有報道SB203580可以抑制NF-κB依賴的轉錄過程，但本實驗發(fā)現(xiàn)NF-κB65信號通路蛋白阻斷劑PDTC對p-P38MAPK也有強烈的抑制作用，且作用強度明顯高于SB239063。按推論P38是NF-κB65的上游蛋白，那為何抑制了下游蛋白，上游蛋白也要減少，是否PDTC在抑制NF-κB65的同時，p-P38MAPK也是其作用位點，這些疑問尚需實驗證實。

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