川芎嗪長循環脂質體包封率的測定

陳道陽 陳曉丹 王利勝

1.廣東省人民政府機關門診部，廣東廣州 510030；2.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州 510006

川芎嗪是從中藥川芎中提取的一種主要有效成分，具有擴張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善微循環等多種藥理活性[1]，臨床主要用于治療動脈粥樣硬化、冠心病、腦血管病、肺動脈高壓等疾病[2]。長循環脂質體是一種具有多功能的靶向藥物載體，其在體內可阻止巨噬細胞對脂質體的識別和攝取，而極大延長脂質體在血液中的循環時間[3]。把川芎嗪制成長循環脂質體制劑，可顯著改善川芎嗪口服吸收差、生物利用度低、半衰期短、代謝快等問題，有效提高了川芎嗪的療效。本實驗旨在建立簡單可行、穩定可靠的分析方法，以準確測定川芎嗪在制劑中的含量和包封率，為評價和控制川芎嗪長循環脂質體的質量提供依據。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀：Waters515泵、2487紫外檢測器（美國Waters公司）；N3000色譜工作站（浙江大學）；精密分析天平AUW120D（日本島津公司）；JB-3型定時恒溫磁力攪拌器（上海雷磁新涇儀器有限公司）；微孔濾膜（德國ME MBRANA公司）。

TMP（含量>98.5%，江蘇南京澤朗醫藥科技有限公司）；大豆卵磷脂（上海泰偉藥業）；膽固醇（上海伯奧生物科技有限公司）；PEG3000-DSPE（德國lipoid公司）；葡聚糖凝膠-G50（上海藍季科技發展有限公司）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（天津市福晨化學試劑廠）；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

2.1.1 川芎嗪長循環脂質體[4]采用乙醇注入法制備，精密稱取處方量的川芎嗪、卵磷脂、膽固醇和PEG3000-DSPE，加入適量的無水乙醇使之溶解。將上述乙醇溶液勻速注入到水浴60℃的PBS 6.5溶液中，恒溫快速攪拌至無醇味，靜置，過0.45 μm的微孔濾膜，即得。

2.1.2 空白脂質體 按處方精密稱取卵磷脂、膽固醇、PEG 3000-DSPE等輔料，同法制備不含藥物的空白脂質體，備用。

2.2 分析方法的建立[5]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：迪馬platisil ODS柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），Phenomenex保護柱；流動相：甲醇-0.5%冰乙酸（40∶60）；流速：1 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：298 nm；進樣量：10 μL。

2.2.2 專屬性試驗 取空白脂質體和川芎嗪長循環脂質體各0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇破乳并定容至刻度，搖勻，分別作為陰性溶液和樣品溶液。將陰性溶液、樣品溶液和43.60 μg/mL的川芎嗪對照品溶液分別進行HPLC分析。色譜圖見圖1，川芎嗪的保留時間約為13.2 min，峰形良好，空白輔料對川芎嗪的測定無干擾。

2.2.3 標準曲線的繪制 精密稱取川芎嗪對照品8.72 mg，用甲醇配制成濃度為 1.09、2.18、5.45、10.90、21.80、43.60 μg/mL的對照品溶液，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積A為縱坐標，對照品溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線。得到線性回歸方程：A=24 178.21C-101.40（r=0.9995），表明川芎嗪在 1.09～43.60 μg/mL 濃度范圍內線性關系良好。

2.2.4 精密度試驗 取10.90 μg/mL川芎嗪對照品溶液，連續進樣6次，測定峰面積，計算得到RSD為1.41%，說明該法精密度良好。

2.2.5 穩定性試驗 取川芎嗪長循環脂質體適量，用甲醇破乳并稀釋，搖勻，于室溫放置 24 h，分別于 0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣分析，記錄峰面積，計算得到RSD為1.79%，說明樣品溶液在24 h內基本上穩定。

2.2.6 重復性試驗 取同一批號的川芎嗪長循環脂質體5份，按“2.2.2”項下配制樣品溶液，進行分析，結果川芎嗪質量濃度穩定，RSD為1.26%，符合要求。

2.2.7 回收率試驗 精密量取 2.18、10.90、43.60 μg/mL的川芎嗪對照品溶液1 mL，分別加入空白脂質體1 mL，加甲醇破乳并定容至10 mL，配制成低、中、高3個濃度的混合溶液各5份，進行液相色譜分析，計算回收率，分別為98.55%（RSD=1.59% ），97.64% （RSD=1.37% ），99.14% （RSD=1.78%），結果表明該分析方法的回收率符合要求。

2.3 分離方法的建立[6]

2.3.1 洗脫曲線的繪制 精密量取川芎嗪長循環脂質體0.25 mL，上葡聚糖凝膠-G50微型柱（15 cm×0.8 cm），以PBS 6.8為洗脫液，流速為0.5 mL/min，每毫升為1管收集洗脫液，共收集25管。可見，乳白色的脂質體富集于3～10管洗脫液中。將每管洗脫液用甲醇定容至2 mL，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，測定川芎嗪的含量。以藥物質量濃度為縱坐標，收集份數為橫坐標，繪制洗脫曲線。圖2結果表明川芎嗪長循環脂質體于3～12 mL被洗脫出，而末包封的游離藥物于15～23 mL被全部洗脫出來，中間有3 mL間隔，確保了脂質體與游離藥物能夠完全分離。

2.3.2 柱回收率測定 精密量取2.18、10.90、43.60 μg/mL的川芎嗪對照品溶液0.25 mL上柱，按上述條件進行洗脫，收集15～23 mL的洗脫液，稀釋，定容，過0.22 μm微孔濾膜，HPLC法分別測定藥物濃度，計算川芎嗪游離藥物的上柱洗脫回收率。結果低、中、高濃度的川芎嗪柱回收率分別為97.41% （RSD=1.24% ），99.01% （RSD=1.51% ），96.80%（RSD=1.39%），表明葡聚糖凝膠-G50對川芎嗪沒有吸附作用，在以上條件下藥物可被完全洗脫。

2.3.3 川芎嗪長循環脂質體包封率的測定[7]精密量取川芎嗪長循環脂質體混懸液0.25 mL，緩緩加于葡聚糖凝膠-G50微型柱（15 cm×0.8 cm）頂部，用 PBS 6.8以 0.5 mL/min的流速進行洗脫，以1 mL/管為單位收集3～12管的洗脫液，合并，加甲醇破乳并定容至18 mL，混合均勻，過0.22 μm微孔濾膜，HPLC測定脂質體中包封的藥量。另取川芎嗪長循環脂質體混懸液0.25 mL，用甲醇破乳并稀釋定容至5 mL，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，進樣分析，測定的川芎嗪的含量為包封和未包封的藥物總量。按以下公式計算包封率：包封率=脂質體中包封的藥物／藥物總量×100%。三批川芎嗪長循環脂質體樣品的包封率測定結果見表1。

表1 川芎嗪長循環脂質體的包封情況（%）

3 討論

3.1 測定方法的選擇

脂質體包封率的測定方法有很多，在前期試驗中曾采用超速離心法，在轉速20 000 r/min以上長時間離心，但脂質體仍難以完全沉淀分離，而且在高轉速條件下部分脂質體可能被破壞而導致藥物滲漏；透析法雖能有效分離，但操作耗時過長[8]。相比之下，凝膠柱色譜法簡單可靠，能使包封藥物和游離藥物得到較好的分離。

3.2 葡聚糖凝膠柱分離條件

本研究選用葡聚糖凝膠G-50能達到較好的分離效果。在分離過程中，色譜柱的徑高比、洗脫液的流速及上樣量均會影響脂質體與游離藥物的分離效果[9]。宜選擇能達到最大分離程度的洗脫條件，才能保證包封率測定的準確性。通過前期篩選試驗，選擇徑高比為15 cm×0.8 cm，上樣量為0.25 mL，洗脫液為PBS 6.8，流速為0.5 mL/min的洗脫條件，能使川芎嗪長循環脂質體可與游離藥物達到最大程度分離。

3.3 流動相的選用

本文建立了準確、穩定的液相色譜分析方法，在選擇流動相條件時，若單純以甲醇-水作流動相，會導致峰形拖尾嚴重，可能是由于川芎嗪堿性氮原子易與柱上未完全封閉的-OH產生氫鍵結合[10]，使其難以洗脫，造成拖尾。因此參考文獻[11-12]在流動相中加入了少量冰乙酸，以調整峰形，達到了良好的效果。

[1]周昌奎，吳曉華.川芎嗪臨床應用及研究進展[J].海峽藥學，2004，16（6）：3-5.

[2]胡國芬，王建平.川芎嗪的藥理作用及臨床應用進展[J].中國藥物與臨床，2006，6（10）：77.

[3]曹純潔.長循環脂質體的研究進展[J].藥學實踐雜志，2005，23（1）：1-3.

[4]宏偉，陳大為，趙秀麗，等.姜黃素長循環脂質體的制備及評價[J].中國中藥雜志，2008，33（8）：889-892.

[5]王利勝，陳曉丹，呂耿斌，等.自乳化輔料對川芎嗪緩釋固體分散體釋放度的影響[J].中國新藥雜志，2012，21（23）：96-99.

[6]黃義昆，梁建成，韋敏，等.影響鹽酸川芎嗪脂質體包封率各因素分析[J].中國藥師，2006，9（9）：825-827.

[7]魯會俠，馮鎖民.紫杉醇脂質體藥物包封率的測定[J].中國新藥雜志，2007，16（10）：778-780.

[8]馮秀珍，丁燕飛，李新，等.高效液相色譜法測定槲皮素納米脂質體藥物含量及包封率[J].藥物分析雜志，2008，28（4）：556-558.

[9]高曉黎，季興梅.葡聚糖凝膠柱色譜法測定脂質體包封率的條件篩選[J].中國藥學雜志，2003，28（7）：515-517.

[10]桂雙英，溫志強，彭代銀，等.漢防己甲素脂質體包封率的測定[J].安徽中醫學院學報，2009，28（5）：70-72.

[11]王利勝，石宗豐，郭琦，等.川芎嗪、阿魏酸微透析體外回收率及體內穩定性的研究[J].中成藥，2011，33（2）：304-308.

[12]夏祖猛，王利勝，賴寶林，等.芎冰微乳在新西蘭兔體內的藥動學研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（11）：119-121.