HPLC法測定樂舒洗液中苦參堿和蛇床子素

毛桂福 歐人豪 黃玉玲 龍鳳珍

1.廣西壯族自治區柳州市婦幼保健院，廣西柳州 545001；2.桂林醫學院，廣西桂林 541004

樂舒洗液是廣西柳州市婦幼保健院的傳統制劑（批準文號：桂藥制字Z02060005），其主要成分有蛇床子，苦參，黃柏，鶴虱，白鮮皮，百部，花椒等，具有抗菌，消炎，止癢，收斂，殺滅陰道滴蟲等作用。方中蛇床子為君藥，所含主要有效成分蛇床子素具有抗菌、止癢、抗變態反應、增強免疫力等作用[1-2]。原標準中無主要成分含量的測定項，為加強對該制劑的質量控制，保證制劑療效，筆者在參考有關文獻[3-12]的基礎上，采用高效液相色譜法同時測定了制劑有效成分苦參堿和蛇床子素的含量。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT四元梯度高效液相色譜系統（LC-20AT泵，Rheodyne 7725i型進樣閥，SPD-20A紫外檢測器，CTO-20A柱溫箱，DGu-20A在線脫氣機，日本島津），PHS-3C型PH計（上海精密科學儀器有限公司），KQ-300DB型數控超聲波清洗器（昆山市超生儀器有限公司），HANGPINGFA1004型電子天平（上海天平儀器廠）。

苦參堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110 805-200508），蛇床子素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110822-200305）。甲醇、乙腈為高效液相色譜純試劑，水為重蒸餾水，其他使用試劑均為分析純，樂舒洗液（柳州市婦幼保健院制劑室，批號：20120810、20120704、20120516、20110701、20110421）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）柱；柱溫30℃；流動相為乙腈-0.2%三乙胺（磷酸調pH 7.0）梯度洗脫（0～5 min：28%乙腈，9～20 min：72%乙腈，23～28 min：28%乙腈）；流速 1.0 mL/min；檢測波長：220 nm（0～10 min）和 320 nm（10～28 min）；進樣量為 20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取苦參堿對照品22.5 mg至容量瓶中，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得苦參堿對照品儲備液。精密稱取蛇床子素對照品18.4 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得蛇床子素對照品儲備液。儲備液置-20℃冰箱保存。臨用前，精密取蛇床子素對照品儲備液2.0 mL，加甲醇稀釋并定容至10 mL，即得368.0 μg/mL的蛇床子素對照品工作液；精密取該蛇床子素稀釋液1.0 mL，加甲醇稀釋并定容至10 mL，即得36.8 μg/mL的蛇床子素對照品工作液。

2.2.2 供試品溶液 樂舒洗液超聲30 min后，精密量取4 mL置10 mL具塞玻璃試管中，加0.5 mL濃氨溶液，用4 mL乙酸乙酯振搖提取1 min，2000 r/min離心1 min，分取有機相至另一個10 mL離心管中置95℃水浴氮氣吹干，共提取4次（每次4 mL）。精密加2 mL甲醇至離心管中，渦旋溶解殘渣，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 另按處方比例取缺苦參和缺蛇床子的藥材，按照樂舒洗液制備工藝制備缺苦參和缺蛇床子陰性樣品，再按供試品溶液制備方法操作即得缺苦參和缺蛇床子陰性樣品溶液。

2.3 系統適應性

分別取陰性樣品、混合對照品及供試品溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1），結果表明，供試品色譜中苦參堿和蛇床子素保留時間分別為7.6 min和19.9 min，與對照品溶液的保留時間一致；陰性樣品在該色譜條件下對供試品測定無干擾，分離度良好。理論塔板數以苦參堿色譜峰計算應不低于3000，以蛇床子素峰計算應不低于30 000。

圖1 高效液相色譜圖

2.4 線性關系

精密吸取苦參對照品儲備液、蛇床子素對照品工作液適量至同一容量瓶中，加甲醇定容至5.0 mL，配制成含苦參堿和蛇床子素分別為：1237.5和36.8、900.0和22.1、630.0和 8.8、450.0 和 3.5、315.0 和 1.4、225.0 和 0.6 μg/mL 的 系列混合對照品溶液。分別進樣20 μL，記錄峰面積。以對照品濃度（C）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線得苦參堿、蛇床子素的回歸方程及相關系數分別為：A1=17 737C1-55 443，r=0.9998；A2=87 876C2+12 670，r=0.9999。結果表明，苦參堿和蛇床子素濃度分別在225.0～1237.5 μg/mL和0.6～36.8 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗

精密取同一混合對照液連續進樣6次，苦參堿和蛇床子素的RSD分別為1.0%（n=6）和0.6%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、12 h 進樣測定，記錄峰面積。苦參堿和蛇床子素的RSD分別為1.1%（n=6）和4.0%（n=6），表明樣品室溫放置12 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取同一批號樣品6份，按“2.2.2”項下方法制備6份供試品溶液，進樣測定含量。結果，苦參堿和蛇床子素的RSD分別為 1.4%（n=6）和 2.4%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密取4 mL已知含量的樣品9份，分別置10 mL離心管中，分別加入一定量的苦參堿、蛇床子素對照液，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，依法測定。結果苦參堿和蛇床子素的平均回率分別為97.96%和101.31%，RSD分別為3.63%和4.02%，見表1、2。

表1 苦參堿的加樣回收率

表2 蛇床子素的加樣回收率

2.9 樣品含量測定

取不同批次樣品5批，按擬定方法制備各供試品溶液，分別精密吸取各溶液20 μL進樣分析，并計算其含量，結果見表3。

表3 樂舒洗液中苦參堿、蛇床子素的含量（μg/mL）

3 討論

在流動相的選擇中，分別嘗試用不同比例的乙腈-0.2%三乙胺做為流動相進行等梯度洗脫，結果表明，苦參堿和蛇床子素的極性差異較大，且該制劑雜質多，用等梯度流動相難以進行分離測定。曾采用甲醇-水系統作為流動相進行梯度洗脫，結果樣品中苦參堿與其他雜質也不易分離[3]。對不同pH值的流動相進行了試驗，結果表明：pH值對苦參堿色譜峰影響較大，pH值過低，苦參堿出峰過快；pH值過高，苦參堿色譜峰有拖尾現象；流動相pH為7.0時，分離效果最好。

文獻方法檢測苦參堿和蛇床子素分別采用220 nm[3-7]和320 nm[8-10]波長。試驗表明：在320 nm波長下未能檢測出苦參堿色譜峰；在220 nm波長下，蛇床子素色譜峰過小，與雜質未能完全分離，且基線漂移較大。改用220 nm和320 nm雙波長檢測，可同時完成對苦參堿和蛇床子素的分離測定。

在相同條件下比較了乙酸乙酯[10]、乙醚[11]以及乙酸乙酯-乙醚混合液（4∶1）等溶劑的提取效率，結果表明：乙酸乙酯對苦參堿的提取率最高，乙醚和乙酸乙酯對蛇床子素提取率相當；苦參堿的堿性較大，在加濃氨條件下提取率較高；苦參堿在水中溶解度較大，因而需用乙酸乙酯提取4次。本制劑中含有明礬，沉淀較多，超聲后直接制成供試液進行測定，蛇床子素的回收率較低；濾除沉淀后制成供試液，蛇床子素的回收率才有較大的提高，表明沉淀對蛇床子素有較大的吸附作用。

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