口腔癌患者血清核磁共振代謝組學研究

黃奇駿 姚 婕 黎玉君 翁合妹 龔嘉欣 丘翠環 楊永霞

廣東藥學院基礎學院物理與電子學教研室，廣東廣州 510006

口腔癌是一類發生于唇、腭、舌、口底和牙齦等部位的上皮源性惡性腫瘤。目前口腔癌多采用以手術為主的治療方法，但術后患者5年生存率只有50%左右，同時還具有較高的復發風險[1]。核磁共振1H 譜（nuclear magnetic resonance1H，NMR1H）是研究生物樣品代謝變化的一種常用手段，近年來基于核磁共振的代謝組學方法已經得到廣泛應用[2-6]。本文應用核磁共振1H 譜并結合多變量分析方法研究口腔癌患者血清的代謝組特征，尋找與癌變相關的血清代謝標志物，闡明口腔癌患者血清生化過程的改變。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

于廣東藥學院附屬第一醫院收集口腔癌患者血清樣本10例和健康人血清10例（收集時間：2011年11月～2012年4月），置-80℃超低溫冰箱貯存。

1.2 樣品預處理

采樣前，將所有血清樣本解凍，在4℃下，10 000 g 離心10 min。取400 μL 上層血清加至5 mm NMR 測試管中，后加入100 μL 0.2 mol/L 磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L Na2HPO4-0.2 mol/L NaH2PO4，pH＝7.4）和 50 μL 重水，振蕩混勻。

1.3 NMR 實驗

每一個樣品均采集 Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG，relaxation delay-90-（τ-180-τ）n-acquisition） 氫譜，總回波時間為100 ms，3 s 延遲時間，64k 數據點， 采集次數為128。化學位移定標為乳酸甲基雙重峰δ1.33。

1.4 數據預處理

采用軟件TOPSPIN 2.0對所有1H CPMG 譜進行自動積分，積分區間δ0.5～4.6，積分間隔0.01。主成分分析前對每一個譜的積分值進行歸一化處理，后將歸一化值導入軟件 Simca-P 12.0（Umetrics，Sweden）中進行主成分分析。

1.5 統計學方法

采用 SPSS（Version 13.0，SPSS Inc.，USA）軟件對正常人和口腔癌患者血清代謝物的歸一化積分值做獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 健康人與口腔癌患者血清CPMG1H 譜比較

由圖1 可清楚地觀察到亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸、糖蛋白、谷氨酸、乙酰乙酸、谷氨酰胺、甲胺、二甲胺、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、膽堿和葡萄糖等信號峰。對比健康人與口腔癌病人血清CPMG1H 譜，可以發現膽堿、葡萄糖和乳酸有明顯的變化[7]。為了能夠篩選出具有顯著性差異的代謝標志物，將利用主成分分析和統計分析對兩組樣本的血清代謝組數據進行分析。圖1 為代表性的健康人與口腔癌患者CPMG1H 譜。

圖1 健康者（a）與口腔癌患者（b）血清CPMG1H 譜

2.2 多變量分析

為了篩選出口腔癌患者血清代謝標志物，本文采用代謝組學常用的多變量分析-主成分分析方法對上述得到的CPMG1H的歸一化積分數據進行分析。主成分分析方法能夠根據樣本代謝圖譜的特征給出樣本間的分類，同時還可以篩選出對區分有較大貢獻的代謝物（即化學位移區間）。對健康者（○）和口腔癌患者（●）血清CPMG1H 譜的主成分分析結果見圖 2（PC1 比 PC2，R2＝82.5%）。可以得到口腔癌患者血清中氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸），谷氨酸、糖蛋白、甲胺和二甲胺、葡萄糖的含量是升高的，而乳酸和膽堿的含量降低。

3 討論

通過得分圖（圖2a）可以看到，健康人和口腔癌患者血清樣本在PC2 維可以完全區分開，通過對PC2值進行統計分析，結果表明這兩類樣本在PC2 維具有顯著性差異（P＜0.01）。負載圖（圖2b）給出了兩類樣本中主要的代謝物變化，口腔癌患者血清中氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸），谷氨酸、糖蛋白、甲胺和二甲胺、葡萄糖的含量是升高的，而乳酸和膽堿的含量降低。進一步通過統計分析發現這些代謝物均具有顯著性差異（P＜ 0.05）。

口腔癌患者血清中乳酸含量是降低的，這可能表明在口腔癌患者血清代謝中無氧糖酵解過程減少，這與鼻咽癌血清代謝中乳酸變化一致[8]。磷脂膽堿和膽堿是存在于細胞膜上的磷脂，而口腔癌患者血清膽堿含量的降低可能與細胞膜破壞，細胞凋亡過程出現了失衡狀態有關。

圖2 健康者（○）和口腔癌患者（●）血清CPMG1H 譜主成分分析（a）得分圖（b）負載圖

此外，亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸在口腔癌患者血清中含量是明顯增加的。糖蛋白和谷氨酸對免疫功能的維持有重要作用，如提高機體代謝和改善機體免疫狀況等。糖蛋白和谷氨酸含量的增加表明其代謝過程受到調控，相應的調控功能受到影響[9]。

總之，通過對口腔癌患者血清代謝組的研究，并結合主成分分析方法篩選出了口腔癌患者血清代謝標志物，這將為口腔癌診斷提供可靠的分子水平上的代謝證據。

[1]Brandwein GM，Teixeira MS，Lewis CM，et al.Oral Squamous Cell Carcinoma： Histologic Risk Assessment， but Not Margin Status， Is Strongly Predictive of Local Disease-free and Overall Survival[J].Am J Surg Pathol，2005，29（2）：167-178.

[2]楊永霞，楊生義，梁敏鋒，等.基于核磁共振波譜的乙肝患者血清代謝組研究[J].第二軍醫大學學報，2010，31（3）：288-291.

[3]高崗，楊根金，婁子洋.腎虛證大鼠尿液的核磁共振譜代謝組學研究[J].第二軍醫大學學報，2009，30（5）：565-568.

[4]Lehnhardt FG，Bock C，Rohn G，et al.Metabolic differences between primary and recurrent human brain tumors：a 1H NMR spectroscopic investigation[J].NMR Biomed，2005，18（6）：371-382.

[5]陶曉峰，楊根金，王曉鈞，等.離體眼眶腫瘤及正常組織超高場磁共振波譜特點的比較[J].第二軍醫大學學報，2006，27（8）：882-884.

[6]楊永霞，陳阿麗，梁敏鋒，等.慢性乙肝與重癥乙肝患者血清代謝組比較[J].中國醫藥導報，2010，7（18）：27-28.

[7]楊永霞，梁敏鋒，陳阿麗，等.應用核磁共振代謝組學方法分析食管癌患者血清代謝物[J].江蘇醫藥，2010，36（16）：1867-1868.

[8]符方方，姜苗苗，王希成，等.基于核磁共振波譜的鼻咽癌患者血清代謝組研究[J].廣東藥學院學報，2011，27（3）：312-315.

[9]Fowler A，Rappas A，Holder J，et al.Differentiation of human prostate cancer from benign hypertrophy by in vitro1H NMR[J].Magn Reson Med，1992，25（1）：140-147.