扶芳藤合劑對兔病態竇房結綜合征Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達的影響1）

朱智德，盧健棋，韋 斌，姜 浩，王慶高

病態竇房結綜合征（sick sinus syndrome，SSS）是由于心臟竇房結及其周圍組織的結構與功能的病理改變，導致心肌起搏功能和／或心肌傳導束沖動傳導障礙，產生各種心律失常的綜合征。竇房結（atrionector）是心臟的最高起搏點。竇房結由P細胞、T細胞和心房肌細胞所組成：P細胞（起搏細胞、竇房結細胞）形圓小（5μm～10μm）、色淡蒼白（pale）、分化程度低、類似原始心肌細胞。具有自動起搏的特性。竇房結細胞聯結包括P－P細胞（起搏細胞）、P－T（移行細胞）、T－T細胞、T－心房肌細胞之間的連接，其連接方式包括縫隙連接（gapjunction，GJ）、橋粒（desmosome）和黏著連接（adhering junction）三種。縫隙連接蛋白（connexin，Cx）是構成細胞間GJ的分子基礎。縫隙連接由連接蛋白家族跨膜蛋白組成，研究已確定在心臟表達的Cx家族成員主要有Cx43、Cx40、Cx45。

中醫學根據SSS的臨床表現，多將其歸屬于“心悸”、“頭暈”、“胸痹”、“厥證”、“脈遲癥”、“脈結代”等范疇。復方扶芳藤合劑主要由扶芳藤、人參、黃芪等藥組成，有益氣行血，溫補心脾腎之功。在臨床中發現扶芳藤合劑對SSS有較好的療效，其作用機制尚未明了。本實驗在成功建立家兔SSS模型的基礎上，通過觀察扶芳藤合劑對竇房結細胞Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達的影響，探討其治療病態竇房結綜合征的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性家兔40只，體重（2.5±0.5）kg，由廣西中醫藥大學實驗動物中心提供，常規飼養，自由進食進水。

1.2 實驗藥品和試劑 復方扶芳藤合劑由廣西中醫學院制藥廠提供（規格：每支10mL）；心寶丸，廣東省藥物研究所制藥廠生產（規格：每丸60mg），以蒸餾水配成0.2g／mL供家兔灌胃用。CX45、CX43蛋白特異性一抗（Rabbitanti－45，Rabbitanti－43，Rabbitanti－4，美國Sigma公司）

1.3 實驗儀器 電生理儀，常用手術器械，DF -5A心臟電生理刺激儀 （蘇州市東方電子儀器廠），針形四極心電電極（廣西中醫藥大學實驗中心提供），DH- 140動物人工呼吸機（浙江醫科大學儀器實驗廠），BMJ -1型生物組織包埋機（上海京工實業有限公司），RM2315切片機（德國Leica公司），奧林巴斯BX51T生物顯微鏡（型號BX51T-32F01，日本OLYMPUS公司），奧林巴斯顯微照相機（型號 C－7070，日本 OLYM－PUS公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與給藥方法 將40只大耳白兔按隨機數字表隨機分為正常組（A組）、模型組（B組）、復方扶芳藤合劑高劑量組（C組）、復方扶芳藤合劑低劑量組（D組）、心寶丸組（E組），每組8只。正常組不進行造模，其余各組于模型成功后第5天開始灌胃給藥，連續2周，每天1次。C組給予復方扶芳藤合劑3.6g／（kg·d），D組給予復方扶芳藤合劑0.9g／（kg·d），E組給予心寶丸0.3g／（kg·d）。A組、B組以等體積的生理鹽水灌胃。

1.4.2 SSS模型制作 取以3%戊巴比妥鈉30mg／kg耳緣靜脈麻醉。四肢皮下固定針形心電電極并連接至BL－420F生物機能實驗儀，記錄體表心電圖。氣管插管連接呼吸機，潮氣量22mL。沿胸骨正中右緣2mm～3mm剪斷第2～4肋骨，縱行開胸，注意避免損傷右胸膜，經縱隔打開心包，暴露右心房及右心耳。用干棉簽拭干心臟竇房結區（右上腔靜脈與右心房交界處），用20%甲醛溶液浸潤2mm×3mm棉球外敷竇房結區3 min～5min，當出現心率較濕敷前下降30%～50%，出現竇性停搏、快慢綜合征、竇房阻滯或結性逸搏為竇房結急性損傷模型成功標志。取出棉球，持續觀察1h，待心率穩定，青霉素生理鹽水沖洗胸腔，逐層關胸。

1.4.3 竇房結取材 行竇房結電生理功能檢測后于耳緣靜脈注入空氣栓塞致死，迅速取出心臟并用生理鹽水沖洗，分離出右心耳及上、下腔靜脈，剪開上、下腔靜脈，于上腔靜脈入口以下至從腔耳角向外下沿界嵴到下腔靜脈口這一區域切取竇房結組織，將組織修剪為3mm×4mm的組織塊，浸泡于4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片。

1.4.4 竇房結組織Cx45、Cx43、Cx40蛋白表達的檢測 采用SABC三步法：切片常規脫蠟至水，3%的H2O2以消除內源性過氧化物酶活性，蒸餾水洗3次。再將切片浸入0.01mol／L的枸櫞酸鹽緩沖液（pH＝6.0）微波爐中加熱3min，冷卻后PBS洗滌2次，5%BSA室溫下封閉20min，滴加適當（50μL）稀釋一抗（兔抗鼠多克隆抗體）4℃過夜；PBS沖洗，滴加生物素化三羊抗兔IgG，37℃20min，沖洗后滴加試劑SABC，37℃20min，再次沖洗后DAB室溫顯色，鏡下控制反應時間，及時終止。蘇木染色、脫水、透明、封片。對照組設計：以PBS代替一抗為陰性對照。陽性為棕黃色，陰性不顯色。用Image－pro plus 6.0圖像分析系統，每張切片隨機選取3個高倍視野測定免疫組化圖像中平均光密度。

1.5 統計學處理 用SPSS 19.0軟件包進行統計學處理。數據用均數±標準差±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為有統計學意義，檢驗采用雙側檢驗。

2 結 果

手術造模后模型組竇房結組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達下降，明顯低于正常組，經過藥物干預后，復方扶芳藤合劑大、小劑量中藥組竇房結組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達增高，其中，大劑量組竇房結組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達明顯高于模型組（P＜0.05）；而大劑量組與心寶丸組比較，竇房結組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。小劑量組干預后竇房結組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達較模型組增高，其中Cx40較模型明顯增高（P＜0.05）。詳見表1。

表1 竇房結組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達（±s）

表1 竇房結組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達（±s）

組別 n Cx45 Cx43 Cx40 A組6 0.321±0.012 0.329±0.010 0.332±0.007 B組 6 0.281±0.008 0.259±0.009 0.280±0.011 E組 6 0.310±0.0112） 0.313±0.0132） 0.323±0.0122）C組 6 0.296±0.0101） 0.275±0.0091）4） 0.318±0.0152）D組 6 0.314±0.0132）3） 0.326±0.0162）3） 0.339±0.0142）3）與A組比較，1）P＜0.05；與B組比較，2）P＜0.05；與C組比較，3）P＜0.05；與E組比較，4）P＜0.05

3 討 論

竇房結是哺乳動物心臟傳導系統的重要組成部分，是控制心臟電活動的中心，竇房結細胞間相互連接的獨特性便決定著細胞間電傳導的特殊性。在竇房結組織中，Cx主要有兩個職能：①維持心臟正常節律；②將沖動傳到心房且不受超激化的影響[1]。已證實在心臟表達的Cx家族成員主要有Cx43、Cx40、Cx45。運用免疫組化和電生理方法研究竇房連接區GJ特征，結果兔竇房結中央P細胞表達Cx40，在結周圍混合表達Cx43、Cx40[2]。Coppen等[3]對兔心臟免疫組化共聚焦顯微鏡觀察研究發現Cx45和Cx40竇房結中央表達，竇房結與界嵴交界區大部分區域顯示在界嵴表達Cx43心肌細胞與結區表達Cx 45和Cx40細胞有明顯的分界線，然而在心臟內面竇房結周圍與界嵴的過渡帶共同表達Cx43和Cx45。竇房結組織損傷后，必將影響竇房結細胞間的特化連接，引起細胞間電偶聯與機械耦聯異常使竇房結功能下降，導致相應傳導速度和各向異性傳導發生改變，從而出現傳導減慢及傳導阻滯等現象，引起各種心律失常，故對Cx表達的干預情況，可以作為評價治療病態竇房結綜合征藥物作用之一。

病態竇房結綜合征動物模型較多，各有不同的特點，用甲醛溶液濕敷竇房結區建立病態竇房結綜合征模型的方法被廣泛用于基礎實驗研究。此法操作簡單，容易被實驗人員掌握，對竇房結損傷程度較輕，損傷后去除甲醛溶液，心肌組織功能還能一定程度的恢復，因此，實驗進程容易能被實驗人員掌控。在實驗過程中采用從胸骨右緣縱行開胸，經縱隔打開心包，可以避免破壞胸膜腔，減少了氣胸等并發癥的發生[4]。

中醫學里沒有“病態竇房結綜合征”的病名，根據其臨床表現，多將其歸屬于“心悸”、“頭暈”、“胸痹”、“厥證”、“脈遲癥”、“脈結代”等范疇。對其病機，古代早有論述。如《素問·痹論》亦指出：“脈痹不已，復感于邪，內舍于心”，“心痹者，脈不通，煩則心下鼓”，《瀕湖脈學》云：“遲而無力定虛寒，代脈都因元氣虛，結脈皆因氣血凝”。中醫學認為病態竇房結綜合征以陽氣虛衰為本，即以心陽虛、腎陽虛、脾陽不足為主；寒凝氣滯、血瘀、痰濁為標，乃本虛標實之證。血瘀、寒凝、痰濕等標實均因陽氣不足而成，而陽虛則為氣虛之甚，故病竇之治應以益氣助陽為法，尤應以大補元氣為治療關鍵。

復方扶芳藤合劑主要由扶芳藤、人參、黃芪等藥組成，扶芳藤補腎強筋，行氣活血；現代藥理發現扶芳藤具有良好的心血管藥理作用，可延長小鼠心肌缺氧的存活時間，抑制血栓形成，改善去甲腎上腺素（NA）所致的腸系膜微循環障礙，并可擴張耳廓微血管。人參大補元氣，現代藥理研究認為，人參含有人參皂苷等多種有效成分，具有強心、升壓、興奮心臟，增強心肌收縮縮，提高心率的作用。黃芪補益心氣 ，填補胸中宗氣，以助心陽而令血行。現代藥理研究表明其主要成分有改善心功能 ，改善心肌代謝等作用。人參、黃芪還具有強心、升壓、提升心率及擴張血管，增加冠脈血流量，改善心肌缺血，改善微循環與抗血小板聚集等作用。諸藥合用，共奏益氣行血，溫補心脾腎之功，使心氣充裕，心陽振奮，心肌鼓動有力，心率增加，諸癥緩解。同時，復方扶芳藤合劑是具有抗心肌缺氧、抗衰老、抗應激、改善微循環等作用。

本研究結果提示，大劑量的復方扶芳藤液對竇性心律失常有明顯的調節作用，研究顯示大劑量復方扶芳藤液能提高心率，其治療機制可能與降低竇房結恢復時間（SNRT）、校正竇房結恢復時間（CSNRT）、竇房傳導時間（SACT），提高竇性心律，促進竇房結組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達有關。小劑量的復方扶芳藤液對竇性心律失常也有一定的調節作用，研究顯示小劑量復方扶芳藤液也能提高心率，降低SACT、SNRT、CSNRT，提高竇性心律，促進竇房結組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達，實驗數據雖然與模型組比較差異無統計學意義，但在小劑量的基礎上適當再增加劑量可能對竇房結病變的預防有意義，因此小劑量的復方扶芳藤液需要進一步研究。

本次試驗研究能證實復方扶芳藤合劑對SSS有良好的療效，并進一步揭示其分子作用機理，必將擴大復方扶芳藤合劑的臨床應用范圍，從而產生巨大的經濟效益和社會效益。鑒于中藥治療的多靶點性，該藥的其他藥理作用尚待進一步挖掘并加以證實。

[1]Jongsma HJ.Diversity of gap junctional proteins：Dose it play a role in cardiac excitation[J].Cardiovasc Electrophysiol，2000，11：2008－2230.

[2]Verheule S，Marian JA，Van Kempen，et al.Gap junctions in the rabbit sinoatrial node[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001，280：2103－2115.

[3]Coppen SR，Kodama I，Boyett MR，et al.Connexin 45，a majory connexin of rabbit sinatrial node，is coexpressed with connexin 43 in the restricted zone at the nodal－crista terminals border[J].J Histochem Cytochem，1999，47（7）：907－918.

[4]歇乃志，張守紅.手術方法建立竇房結功能損傷模型進展.現代臨床醫學，2009，35（2）：83－85.