一種改進的賴氨酸濃度測定方法

姜安娜 曹名鋒 李慶剛 鄭平 楊洪江 孫際賓

賴氨酸是世界上僅次于谷氨酸的第二大氨基酸品種，目前主要應用于飼料添加劑［1-3］、食品添加劑和醫藥中間體［4-8］。隨著科技的發展，賴氨酸品種已經發展出賴氨酸鹽酸鹽、蛋白賴氨酸和液體賴氨酸等［9，10］。截止到2010年底，世界市場每年的賴氨酸需求量達140萬噸，按照工業賴氨酸計算，其直接市值達200億元，間接市場難以估量［11］。

目前常用的賴氨酸檢測方法主要有酶法、高效液相色譜（HPLC）和化學法（茚三酮）法。酶法主要是通過賴氨酸在特異的氧化酶催化下發生氧化還原反應，其電子產物在生物傳感器電極表面形成電流從而進行測定，檢測準確度和應用性受酶活力和酶價格的限制；HPLC方法采用2，4-二硝基氟苯（DNFB）、1-氟-2，4-二硝基苯基 -5-L-丙氨酰胺（FDAA）等衍生化試劑，雖然能夠精確區分和測定D-/L-型賴基酸的含量，但對儀器精密度和操作人員要求極高，并且易受樣品中雜質成分的干擾，不適合工業發酵液中賴氨酸的檢測；化學法主要指茚三酮方法，基本原理為：氨基酸與水合茚三酮共同加熱后可發生氧化脫氨反應，生成NH3與酮酸；加熱過程中酮酸裂解，放出CO2，自身變為少一個碳的醛，水合茚三酮變為還原型茚三酮。NH3與水合茚三酮及還原茚三酮脫水縮合，生成藍紫色化合物［12］。傳統的茚三酮檢測方法無法排除雜質氨基酸的干擾，且反應過程中易受pH和溫度變化的影響，造成測定結果準確性降低［13，14］。本研究在傳統的茚三酮試劑中添加了鐵離子（Fe3+），通過鐵離子對脯氨酸、鳥氨酸、甘氨酸、精氨酸、組氨酸與茚三酮反應的抑制作用，從而提高茚三酮溶液與賴氨酸反應的特異性［15］。此外，由于賴氨酸發酵過程中產生其他副產物會影響發酵液的pH值，對反應的成色速度和產物的顏色造成影響，進而削弱了分子內基團反應的靈敏性，所以試驗中擬設計不同的緩沖液反應體系，旨在提高茚三酮法檢測賴氨酸的特異性，并實現了對賴氨酸發酵液穩定和準確的檢測。本方法不需要昂貴的設備，方法簡單，試劑便宜，數據精確，適合實驗室檢測和工業應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 化學試劑 21種氨基酸，即甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、色氨酸（Trp）、絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、半胱氨酸（Cys）、蛋氨酸（Met）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、蘇氨酸（Thr）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、組氨酸（His）和鳥氨酸（Ornithine）購自上海生工生物工程有限公司；分析純的茚三酮、氯化鐵、甲基溶纖劑、二甲基亞砜和正己烷購自國藥集團化學試劑有限公司；色譜純乙酸鈉、異硫氰酸苯酯和三乙胺購自Sigma公司；乙腈由Merck公司提供。

1.1.2 儀器和設備 酶標儀為美國Molecular Devices公司產品，恒溫加熱器購自上海一恒科技有限公司，電子天平（0.000 1 g）購自上海梅特勒-托利多儀器有限公司，高效液相色譜儀購自日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 茚三酮-鐵溶液與氨基酸溶液反應［16］首先配制200mmol/L的氨基酸溶液（天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、色氨酸、酪氨酸溶于0.1mol/L的鹽酸，然后用相同體積的0.1mol/L的氫氧化鈉中和，添加去離子水至終濃度200mmol/L；谷氨酰胺由于在酸堿條件下均不穩定，故配成飽和溶液，現配現用；其他氨基酸溶于去離子水）。取20μL氨基酸溶液加入到0.66mL溶液I［373mL甲基溶纖劑與30mL 50％（W/W）

的氯化鐵溶液混合加入600mL緩沖液］和0.37mL溶液II（1 g茚三酮溶于100mL緩沖液）中混合均勻，100℃恒溫加熱40min，快速用自來水冷卻至室溫，加入4mL二甲基亞砜和6mL去離子水，取200μL樣品在480nm波長下（常溫）測定吸光值。

對顯色反應的最佳反應時間、最佳檢測波長進行了摸索，以確定最佳反應條件。另外，還用不同pH值的酸性氯化鉀溶液取代緩沖液來確定溶液顯色反應的最佳pH值以及更換不同的緩沖液確定最佳緩沖體系。

1.2.2 高效液相色譜法（HPLC）檢測賴氨酸生產菌發酵液中賴氨酸的濃度［17］異硫氰酸苯酯柱前衍生-反相高效液相色譜法測定賴氨酸：將賴氨酸生產菌的發酵液分別稀釋20、30和40倍，取出0.4mL置于離心管中，加入1mol/L三乙胺-乙腈溶液0.2mL，異硫氰酸苯酯乙腈溶液0.2mL，漩渦混合器振蕩1min，37℃水浴1h，加入正己烷0.7mL漩渦混合器振蕩1min，靜置60min。用注射器吸取下層溶液，經0.45μm濾膜過濾后置于色譜自動進樣系統，進行洗脫和譜圖分析。

2 結果

2.1 茚三酮法最適檢測條件的摸索

2.1.1 最佳檢測波長和最佳pH的確定 200mmol/L賴氨酸與pH為0.8、1.6、2.4、3.2和4.0的茚三酮-鐵混合液反應，等體積去離子水取代200mmol/L賴氨酸加入反應體系作為對照，通過酶標儀快速讀取吸光值，檢測結果見圖1。對不同pH值的反應混合液進行了波譜掃描發現，最佳掃描波長為480nm。當pH＞2.4時，反應溶液中出現了沉淀，所以試驗選擇在pH＜2.4（即pH為2.2）的環境中進行。

2.1.2 最佳緩沖液的選擇 將不同濃度的賴氨酸溶液（0、50、100、150、200、300、400 和 500mmol/L）與茚三酮-鐵試劑在pH2.2的不同類型的緩沖液體系下進行反應，檢測480nm處的吸光值。結果（圖2）顯示，以甘氨酸-鹽酸和鄰苯二甲酸-鹽酸作為反應的緩沖液體系時，產物在480nm處的吸光值始終處于很小數值范圍內，波形比較緩和。而在檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液體系中進行反應時，480nm處的吸光值較強，呈線性分布，說明檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液是比較理想的緩沖試劑。本試驗選擇pH2.2 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進行后續的試驗。

圖1 不同pH茚三酮-鐵試劑與200mmol/L賴氨酸反應的吸光值

圖2 不同濃度的賴氨酸溶液與茚三酮-鐵試劑在不同緩沖液體系下反應結果

圖3 不同濃度的賴氨酸與茚三酮-鐵試劑在100℃反應的變化

2.1.3 最佳反應時間的確定 選擇線性關系中賴氨酸濃度最高的200mmol/L溶液，與茚三酮-鐵混合溶液在100℃條件下加熱，每隔5min檢測反應溶液在480nm處的吸光值。結果（圖3）表明，反應結束達到穩定期需要的時間基本與賴氨酸濃度成正比。當200mmol/L賴氨酸與茚三酮溶液反應，在沸水浴中加熱至35min時拋物線坡度開始變緩，接近最高點，吸光值的線性關系較好，可以將100℃加熱35min作為200mmol/L賴氨酸完全反應的條件；當待測試樣中賴氨酸濃度低于200mmol/L時，反應時間可以適當縮短。

2.2 茚三酮法對賴氨酸檢測的特異性與靈敏度

2.2.1 改進的茚三酮法對賴氨酸的特異性檢測 在pH2.2 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液條件下，采用常見的21種氨基酸（200mmol/L）與茚三酮-鐵試劑反應，進行350nm-650nm的波譜掃描（圖4），并檢測480nm處的特異性反應（表1），以反應體系中去離子水取代氨基酸為對照。從圖4的波譜掃描結果可以看出，雖然茚三酮與色氨酸反應在390nm處出現最大吸收的波峰，但480nm處吸光值僅為0.02，相反在480nm處只有賴氨酸反應產物出現強吸收峰，其吸收值為0.37，遠高于其他氨基酸。因此，在pH2.2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液條件下，茚三酮-鐵試劑對賴氨酸的反應特異性非常強，可以完全排除其他氨基酸的干擾。

2.2.2 改進的茚三酮法對賴氨酸濃度檢測范圍的確定 配制濃度為0、50、100、150、200、300、400和500mmol/L的賴氨酸溶液與茚三酮-鐵試劑反應，100℃加熱1h，測定產物在480nm處的吸光值。從圖5可以看出，數值分布趨勢較明顯，在賴氨酸濃度0-200mmol/L范圍內其吸光值與賴氨酸濃度呈非常好的線性關系（R2=0.9924），因此茚三酮方法測定的賴氨酸適用濃度范圍為0-200mmol/L。

圖4 21種氨基酸（200mmol/L）與茚三酮-鐵試劑反應的波譜掃描

表121種氨基酸（200mmol/L）與茚三酮-鐵試劑反應結果

圖5 不同濃度的賴氨酸與茚三酮-鐵試劑反應的標準曲線

表2 茚三酮-鐵和HPLC檢測發酵液中賴氨酸含量比較

2.2.3 改進的茚三酮法與HPLC檢測法的比較 以本研究室構建的一株高產賴氨酸的基因工程大腸桿菌經過搖瓶發酵36h后，12000r/min離心10min去除菌體，發酵液上清分別采用茚三酮-鐵試劑法和反相高效液相色譜HPLC法檢測產物賴氨酸的含量。表2中數據顯示，茚三酮-鐵試劑檢測發酵液中賴氨酸含量與HPLC檢測結果幾乎一致，但是HPLC會出現一定的圖譜重疊（譜圖未給出），分析原因可能為發酵液中雜質氨基酸的干擾。茚三酮-鐵法檢測賴氨酸的方法可以克服這個缺點，并且在茚三酮方法簡便易行，對設備和試驗人員要求低，滿足了工業發酵的需要。

3 討論

在改進的茚三酮法檢測賴氨酸的試驗過程中，甲基溶纖劑（GDME）和二甲基亞砜（DMSO）作為有效的分散劑和促溶劑，通過加快分子間化學鍵的形成可以大大促進α-氨基酸和茚三酮的反應，幫助反應溶液中的混合物均勻分布，特別是在高溫反應結束后加入DMSO使數據檢測結果更加精確［16］。然而我們在嘗試低濃度賴氨酸（＜10g/L）的測定時發現，若按照上述材料方法中的4mL DMSO和6mL去離子水加入，就會導致稀釋倍數過大，檢測吸光度數值很小，導致誤差增大，因此可以適當減小稀釋倍數，比如只加1mL DMSO，在480nm下檢測溶液的吸光值，也會得到很好的標準曲線，數值分布趨勢較明顯，在賴氨酸濃度0-6g/L范圍內反應結果吸光值與賴氨酸濃度呈線性關系（R2=0.997），檢測靈敏度為≤1g/L（數據未給出）。

Chinard［15］提出，在強酸性條件下，茚三酮可以與脯氨酸和鳥氨酸反應，使溶液呈現紅色；Hsieh等提出，金屬離子（銅、鐵、錫等）能夠抑制茚三酮與脯氨酸、鳥氨酸、甘氨酸、精氨酸和組氨酸的顯色反應［16，18］，可以一定程度上排除雜質氨基酸的干擾。劉飛飛等［19］在測定賴氨酸最佳反應條件時發現加熱時間過長導致反應結果吸光值下降。此外，據報道pH的變化不僅影響到氨基酸和茚三酮反應的成色速度和產物的顏色，而且可以影響催化反應的機理，即分子內其他一些基團對茚三酮反應的靈敏性，但目前仍沒有通過調節pH來降低其他氨基酸干擾的報道。因此，我們嘗試在加入pH2.2的緩沖液和鐵離子后，發現當茚三酮與賴氨酸反應結束后，吸光值在較長時間內保持穩定，并且反應體系的檢測結果也非常靈敏。

隨著工業生物技術的發展，菌種、藥物等目的試樣的快速篩選變得極為重要，這就需要一套有效的高通量篩選技術來實現小反應體積、高靈敏度和短反應時間的測定。本研究中介紹的方法，當溫度設置為100℃時，容易造成溶劑的揮發，使得反應體系體積和樣品濃度發生變化，影響了高通量的測定。本研究所建立的設備完善的高通量篩選平臺可實現最高溫度為70℃的恒溫儲藏箱對樣品進行加熱，因此我們嘗試將茚三酮-鐵與賴氨酸的反應溫度下調到70℃，采用200mmol/L的賴氨酸溶液與茚三酮-鐵試劑反應，每隔40min檢測反應溶液在480nm處的吸光值，來觀察測定結果的變化（數據未給出）。結果顯示，在8h時拋物線坡度變緩，達到最高點，即200mmol/L的賴氨酸在70℃需要8h才能反應完全，雖然較好地降低了溫度，準確度較高，但是由于時間較長，大大限制了高通量檢測賴氨酸的可行性，所以此方法要想應用于高通量測定還需要進一步的改進。

4 結論

本研究對用于賴氨酸檢測的茚三酮方法進行了改進，在pH2.2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中只有賴氨酸可與茚三酮-鐵試劑發生480nm處的特征顯色反應，其最佳測定條件為100℃反應35min。改進的方法不僅可以排除雜氨基酸和有機酸的干擾，達到快速準確特異測定賴氨酸濃度的目的，而且在工業發酵中可作為簡單可行的方法實現對賴氨酸的定性和定量分析。

［1］ Zelder O, Klopprogge C, Sch?ner H, et al.L-lysine fermentation［J］.Microbial Technolol, 2005, 1（1）：211-240.

［2］ Rao D, Razak SA, Praveena B, Swamy A.Dissolved oxygen concentration analysis of L-Lysine fermentation production by Corynebacterium glutamicum［J］.The Internet Journal of Pharmacology,2008, 6（1）, DOI：10.5580/19f0.

［3］ Anastassiadis S.L-Lysine fermentation［J］.Microbial Technolol,2007, 1（1）：11-24.

［4］ Nelofer R, Syed Q, Nadeem M.Statistical optimization of process variables for L-lysine production by Corynebacterium glutamicum［J］.Türk Biyokimya Dergisi, 2008, 33（2）：50-57.

［5］ Debatosh D, Akshay B, Vidya C.Lysine：Is it worthmore?［J］.Cytotechnology, 2001, 36：3-32.

［6］ Oh JW, Kim SJ, Cho YJ, et al.Strain of corynebacterium glutamicum andmethod for producing L-lysine：US, 5268293［P］.1993-12-7.

［7］ Nakazawa M, Takahashi D, Onishi N, et al.L-Lysine fermentation：US, 20067012152［P］.2006.

［8］ Nakazawa M, Takahashi D, Onishi N, et al.Method for producing lysine derivative：US, 20067012152［P］.2006.

［9］ Emmert JL, Douglas MW, Boling SD, et al.Bioavailability of lysine from a liquid lysine source in chick［J］.Poultry Science, 1999, 78（3）: 383-386.

［10］ 周偉.淺談賴氨酸行業現狀和發展趨勢［J］.發酵科技通訊,2007（6）：31-35.

［11］ 閆洪穎, 柳曉峰.2010年中國賴氨酸市場回顧及2011年展望［J］.中國畜牧雜志, 2011, 47（4）：23-30.

［12］ 王鏡巖, 朱圣庚, 徐長法.生物化學［M］.北京：高等教育出版社, 2002：138-139.

［13］ Friedman M.Applications of the ninhydrin reaction for analysis of amino acids, peptides, and proteins to agricultural and biomedical sciences［J］.Agric Food Chem, 2004, 52：385-406.

［14］ Dietzen DJ, Weindel AL, Carayannopoulos MO, et al.Rapid comprehensive amino acid analysis by liquid chromatography/tandemmass spectrometry：comparison to cation exchange with post-column ninhydrin detection［J］.Rapid Commun Mass Spectrom, 2008, 22（22）：3481-3488.

［15］ Chinard FP.Photometric estimation of proline and ornithine［J］.J Biol Chem, 1952, 91（5）：91-95.

［16］ Hsieh CL, Hsiung KP, Su JC.Determination of lysine with ninhydrin-ferric reagent［J］.Analytical Biochemistry, 1995, 224（1）：187-189.

［17］ 楊菁, 孫黎光, 白秀珍, 周海濤.異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法同時測定18種氨基酸［J］.色譜, 2002,20（4）：369-371.

［18］ Beckwith AC, Paulis JW, Wall JS.Direct estimation of lysine in cornmeals by the ninhydrin color reaction［J］.Food Chem, 1975,23（2）：194-196.

［19］ 劉飛飛, 李群, 于嵐.茚三酮比色法定量檢測賴氨酸條件的研究［J］.中國食品添加劑, 2010, 5：223-234.