高溫處理對轉基因作物種子Bt蛋白含量的影響

張坤 譚桂玉 王保民 南鐵貴

（中國農業大學農學與生物技術學院，北京 100193）

現代生物工程技術可以將外源基因導入并穩定整合于植物體基因組，使其定向遺傳。運用該技術，近幾十年來轉基因作物在全球范圍內飛速發展［1，2］。來源于蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的cry基因作為其中的代表性基因，可表達晶體毒蛋白，對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等多種昆蟲和線蟲均有獨特的殺蟲活性。目前，該基因已經成功轉入玉米、棉花、水稻等主要作物，轉基因抗蟲玉米和抗蟲棉在世界各地普遍種植。轉Bt基因作物降低生產成本，提高單位面積產量，其優點不言而喻，但抗蟲轉基因作物及其產品的環境安全性和食品安全性也越來越受到社會的廣泛關注。雖然研究人員認為Bt蛋白只有在昆蟲腸道堿性環境下才能加工成有殺蟲活性的蛋白，與昆蟲腸道細胞表面受體結合，造成昆蟲腸道穿孔［3］。人畜胃環境為酸性，腸道細胞表面不含殺蟲蛋白受體，因此轉Bt基因作物對人畜是安全的，但大量應用的轉基因作物中Bt蛋白對人畜的長期影響仍時有爭議。

作物種子，如玉米、棉花、水稻等，是人類糧食及油料的最主要來源之一。現今轉基因作物的廣泛種植，使轉基因作物種子不免進入日常飲食，轉基因作物的食品安全引起社會關注［4，5］。雖然這些作物種子中所含的Bt蛋白在食物加工過程中產生降解，但目前這一方面的研究仍鮮見報道。本研究模擬熱加工處理溫度，檢測玉米、棉花種子在高溫處理條件下，所含Bt蛋白的變化情況，以期為解決轉基因食品安全爭論提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 對照常規棉品種“遼棉18”由河間市國欣農研會贈送；轉Bt雜交抗蟲棉品種“鄂雜棉10”及“鄂雜棉29”的F1代種子由湖北省農牧業廳提供。對照常規玉米品種“鄭58”及其雜交轉Bt基因抗蟲玉米品種（研究階段）由中國農業大學農學院化控中心提供。

1.1.2 化學試劑 Bt蛋白檢測所需抗Bt蛋白兔多克隆抗體（pAb）［6］、辣根過氧化物酶標記鼠單克隆抗體（HPR-mAb）［7］、Bt標準蛋白均由中國農業大學農學院化控中心提供，標準蛋白稀釋至濃度100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.625和0 ng/mL作為標準濃度；TMB顯色溶液購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 棉花種子處理 取棉籽去種皮（種子內種皮及其以內部分未受損傷）于烘箱中進行高溫處理，處理溫度為70℃、85℃、100℃、115℃、130℃，各于5、10、15、20、30、40、50和60 min時取樣并即刻研磨成粉，稱取棉花種子粉末0.1 g，用2 mL Na2HPO4-KH2PO4緩沖液［0.1 mol/L，pH7.5，含1%（W/V）的NaCl和0.1%（V/V）吐溫-20，PBST］在4℃提取過夜。提取液5 000 r/min、4℃離心取上清，即為Bt蛋白待測液。每處理3個重復。

1.2.2 玉米種子處理 玉米種子分別置于55℃、70℃、85℃、100℃、115℃、130℃進行熱處理，取樣間隔時間及后續Bt蛋白提取方法同1.2.1。所取玉米種子粉末重量為0.2 g。

1.2.3 Bt蛋白含量測定 熱處理后，棉花及玉米種子提取液按如下步驟檢測Bt蛋白：（1）用Na2CO3-NaHCO3緩沖液（0.05 mol/L，pH9.6）將抗Bt蛋白兔多克隆抗體稀釋到工作濃度后加入酶標板，每孔100 μL。酶標板放入濕盒并置于37℃培養箱溫育3 h；（2）溫育完成，將酶標板從培養箱中取出，棄去孔內液體后每孔加入150 μL PBST，在常溫放置1 min，棄去PBST，重復4次，將板內殘留PBST在吸水紙上甩干；（3）在酶標板中分別加入50 μL玉米、棉花Bt蛋白待測液、各濃度標準溶液，均做3個重復；（4）將Bt HRP-mAb用PBST（含0.1%明膠）稀釋至工作濃度后加入步驟（3）酶標板孔中，每孔50 μL，將酶標板放入濕盒中37℃溫育1 h；（5）同步驟（2）；（6）在酶標板內加入TMB顯色液，每孔100 μL，放入濕盒并于37℃下顯色15 min；（7）顯色結束后每孔加入100 μL 1 mol/L鹽酸終止酶反應；（8）450 nm下測定酶標板各孔的OD值；（9）對標準樣品的濃度和相應的OD值分別取自然對數后繪制標準曲線，并根據標準曲線計算待測樣品中Bt蛋白的含量。

1.2.4 統計分析 原始數據用Excel 2007軟件進行標準曲線建立，用SPSS 17.0軟件進行方差分析。

2 結果

2.1 高溫處理對轉基因棉花種子Bt蛋白含量的影響

依據轉基因植物及其產品成分檢測抗蟲轉Bt基因棉花外源蛋白表達量檢測技術規范（農業部1485號公告），采用ELISA試劑盒檢測作物種子中外源Bt蛋白的含量。檢測結果（圖1-A）表明，棉花陰性樣品在常溫和130℃高溫處理條件下，Bt蛋白的檢測結果無差異，證明所用方法不受雜蛋白影響，可特異性地檢測Bt蛋白。轉基因棉花種子中Bt蛋白含量隨高溫處理時間變化趨勢，如圖1-B、圖1-C所示。高溫處理最初的10 min為含量迅速變化期，Bt蛋白含量顯著下降。10 min后含量變化趨于緩和，曲線進入平臺期。隨著處理溫度的升高，棉籽外源Bt蛋白含量在迅速變化期下降速率越快，在平臺期的蛋白含量越低。棉花種子內的Bt蛋白含量隨著溫度的升高被降解的速度增快被降解量增大。

2.2 高溫處理對轉基因玉米種子Bt蛋白含量的影響

如圖2所示，玉米陰性樣品在常溫和高溫處理條件下，Bt蛋白的檢測結果無差異，證明所用方法可應用于轉基因玉米種子Bt外源蛋白的特異性檢測。轉基因玉米種子Bt蛋白含量隨高溫處理時間變化趨勢與棉花種子相似，含量變化先為迅速變化期，其后為平緩期，迅速變化期隨溫度變化時間長度不同。隨著溫度的升高，玉米種子Bt蛋白含量被降解速度增快被降解量增大。

圖1 棉花種子在高溫處理條件下Bt蛋白含量的變化

圖2 玉米種子在高溫處理條件下Bt蛋白含量的變化

3 討論

3.1 高溫處理棉花和玉米Bt蛋白含量變化比較

已有的文獻報道中［8-10］，關于高溫對Bt蛋白的影響均以生長期葉片為材料，研究40℃左右高溫對Bt蛋白的作用，本研究彌補了高溫對種子內Bt蛋白影響的研究空白。從本研究結果可看出，在一定高溫條件下，棉花和玉米種子中的Bt蛋白在短時間處理時間內均迅速下降至平臺期。平臺期種子在修復機制作用下，貯藏蛋白降解不再顯著。棉花種子內Bt蛋白含量變化與玉米相比較，70℃處理10 min時，玉米種子中的Bt蛋白含量開始逐漸下降，而棉花種子Bt蛋白含量無顯著變化；85℃處理10 min時，玉米種子中的Bt蛋白含量降解至原含量一半，而棉花種子100-115℃處理10 min時其Bt蛋白被降解至原含量一半；在130℃處理時，棉花和玉米種子中的Bt蛋白含量均迅速下降，并大量降解，處理10 min后，玉米種子的Bt蛋白含量幾乎與本底持平，而棉花種子仍可檢測到少量Bt蛋白。玉米種子Bt蛋白對高溫的耐受程度較棉花種子弱，降解速度較平緩。這些現象與兩種作物種子的組成成分不同有關。棉花種子富含油分，其耐高溫能力較淀粉類種子及蛋白類種子強，但油分不易散熱，使種子內部迅速達到高溫，導致Bt蛋白失活；不同品種的棉花由于種子成分含量不同，降解程度存在差異，但總體變化趨勢一致。

3.2 種子Bt蛋白含量與食品加工

根據上述試驗結果，可推測在食品加工時，榨油原料需經歷130℃左右的高溫長時間烘烤［11，12］，同時施以高壓，種子內的Bt蛋白在成油后已大量減少。而后煎炒等加工，溫度遠高于130℃，Bt蛋白徹底降解。水煮加工溫度持續100℃，淀粉類、蛋白類種子中Bt蛋白可顯著降解，但油料種子中仍有Bt蛋白。煎炸烘烤等加工，溫度均高于130℃，持續一段時間后，可使種子內的Bt蛋白完全降解。冷加工或不加工的轉基因種子，缺乏熱處理過程，若不采用其他的處理方法，其內Bt蛋白含量不減少。

4 結論

轉基因作物種子經高溫處理，所含Bt蛋白可顯著降低。在降解過程中，會出現一個迅速下降期，而后蛋白降解緩慢，進入平臺期。隨著處理溫度升高，平臺期所含的Bt蛋白降低。種子成分的不同，所含Bt蛋白對高溫的耐受程度不同。油料種子中的Bt蛋白對高溫的耐受強度高于淀粉類種子。在130℃以上溫度處理，種子Bt蛋白幾乎完全降解。水煮溫度為100℃，Bt蛋白在短時間內無法全部降解。而冷加工或不加工食品，需要通過其他方式減少Bt蛋白的攝入。

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