納豆激酶生產菌BSNK-5鑒定及發酵條件優化

李淑英 聶瑩 杜歡 趙仲麟 袁超 李燕 宋曉燕 唐選明

納豆激酶（Subtilisin NAT）是由枯草芽孢桿菌分泌表達的高效纖維蛋白溶解酶，最早從傳統的日本大豆發酵產品納豆中發現［1］。納豆激酶對纖維蛋白顯示了極高的底物特異性［2］，其血栓溶解活性是纖溶酶的4倍［3，4］。納豆激酶可以直接溶解交聯狀的血栓塊，還可以催化血纖維蛋白溶酶原轉化為血纖維蛋白溶酶，增加體內血栓溶解因子的合成，失活纖維蛋白溶解抑制劑等［4-7］。納豆激酶除了溶解血栓外，還可以降血壓、血脂和膽固醇［8］，誘導晚期玻璃體分解，治療玻璃體視網膜紊亂病人等［6］。與臨床應用的溶栓藥物相比，納豆激酶具有溶纖活性高、安全可靠、無毒副作用、半衰期長、在胃腸道中穩定性好等優點。該蛋白除了靜脈注射外，還可以口服，生產成本低廉［6，9］，具有重要的開發價值。

優化培養基組成和發酵工藝，可以明顯提高芽孢桿菌的納豆激酶產量［9-11］。本試驗對分離篩選的納豆激酶生產菌BSNK-5進行了菌落形態觀察和分子鑒定；并采用單因素和正交試驗對篩選菌株產納豆激酶的液體發酵條件進行了初步研究，以期提高納豆激酶產量，為該酶的進一步擴大培養奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus natto）BSNK-5，由本實驗室分離并保存。

1.1.2 主要試劑 纖維蛋白原（牛血，批號：140626-201009）、尿激酶標準品（1280U/支）和凝血酶（560U/支）均購于中國藥品生物制品檢定所，LB Broth Ultrapure（USB），酵母浸粉（南通香地生物有限公司），胰蛋白胨（OXOID），其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基 斜面和種子培養基：LB培養基。液體發酵培養基：氮源，碳源，Na2HPO40.6％，NaH2PO40.1％，MgSO40.05％，CaCl20.02％，pH7.0。1.1.4 儀器 立式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-50A，上海博迅實業有限公司醫療設備廠）、恒溫培養振蕩器（ZHWY-200H，上海智城分析儀器制造有限公司）、臺式高速離心機（TG16MW，湖南赫西儀器裝備有限公司）、電熱恒溫培養箱（DHP-9082型，上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種鑒定 形態學鑒定：LB培養基培養菌株

BSNK-5，用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察拍照。

分子生物學鑒定：提取BSNK-5的基因組，細菌16S rDNA擴增引物及方法參照文獻［12］，擴增片段送Invitrogen公司測序。測序結果在NCBI網站利用Blast進行比對，調出相似序列，用Clustal X1.83和 MEGA 3.1 軟件構建系統發育樹［13］。

1.2.2 菌種的培養 用接種環挑取斜面菌種，接于種子培養基（裝液量10mL/50mL）中，37℃，200r/min搖床培養24h。然后根據試驗設計，以不同的接種量接于液體發酵培養基（裝液量20mL/100mL）中，設置不同溫度，200r/min搖床培養不同時間。

1.2.3 產酶條件的優化

1.2.3.1 最適氮源優化 固定碳源為2％的葡萄糖，分別采用濃度為1％的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨和酵母浸粉為氮源，其他試劑同1.1.3配置液體發酵培養基。以3％的接種量接菌種于液體發酵培養基中，37℃、200r/m搖床培養72h。離心收集上清液測納豆激酶活力，以確定最佳氮源。每個試驗重復3次。

1.2.3.2 最適碳源優化 據1.2.3.1確定最佳氮源為酵母浸粉，故采用氮源為1％的酵母浸粉，碳源分別采用濃度為2％的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和木糖，其他試劑同1.1.3配置液體發酵培養基。以3％的接種量接菌種于液體發酵培養基中，37℃、200r/min搖床培養72h。離心收集上清液測納豆激酶活力，以確定最佳碳源。每個試驗設3個重復。

1.2.4 酶活測定方法（纖維蛋白平板法）瓊脂糖-纖維蛋白平板的配制：含有1％瓊脂糖的pH7.2 PBS溶液，50℃恒溫水浴45min，加入凝血酶（最終活性0.05U/mL）和同樣溫度下水浴10min的等量含有0.1％纖維蛋白原的pH7.2 PBS溶液，混勻。9cm×9cm的培養皿加入35mL此溶液，凝固后用直徑5mm打孔器打孔，上樣10μL（菌株發酵液的上清液），37℃恒溫培養18h，測量溶解圈的直徑，計算溶解圈的面積，根據尿激酶標準曲線計算酶的活力單位。

尿激酶標準曲線的制作參考馬明等［14］的方法。

2 結果

2.1 BSNK-5菌種鑒定

2.1.1 形態特征 LB平板劃線，37℃培養24h后，菌落圓形，乳白色，不透明，邊緣不整齊，表面干燥，有皺褶，用接種環挑菌落有拉絲現象，菌落與培養基不結合，菌落正反面顏色相同。顯微鏡下個體形態觀察，菌株桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色呈陽性，產芽孢，芽孢橢圓形，中生或近中生（圖1）。

圖1 BSNK-5顯微鏡形態觀察

2.1.2 16S rDNA序列分析及系統發育構建 PCR擴增所得BSNK-5菌株16S rDNA全長1509bp，將BSNK-5的16S rDNA測序結果經Blast 比對，與BSNK-5菌株16S rDNA同源性較高的菌株均為枯草芽孢桿菌菌株，從中選擇15條同源性高于99％的16S rDNA序列構建系統發育樹，結果（圖2）顯示，BSNK-5菌株與Bacillus subtillis 屬菌株在同一分枝上，結合菌株形態特征，初步鑒定BSNK-5為枯草芽孢桿菌屬菌株。

圖2 BSNK-5的系統發育樹

2.2 尿激酶的標準曲線

測量不同濃度尿激酶在纖維蛋白平板上2個互相垂直的溶解圈直徑，并計算溶解圈的面積，重復試驗3次，求平均值，制作尿激酶標準曲線，得出了尿激酶的活力與溶解圈面積呈線性關系，結果見圖3。

圖3 尿激酶標準曲線

由圖3可知，尿激酶標準曲線線性關系為y=1.9769x-106.33，R2=0.9824。此標準曲線可用于測定納豆激酶的活性，根據納豆激酶溶解圈面積大小，可計算出納豆激酶的纖溶活性，即相當于尿激酶的活力單位。

2.3 產酶條件的優化

2.3.1 最適氮源的優化 固定碳源為2％的葡萄糖，分別采用濃度為1％的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨和酵母浸粉為氮源，其他試劑同1.1.3配置液體發酵培養基。以3％的接種量接菌種于液體發酵培養基中，37℃、200r/min搖床培養72h。離心收集上清液測納豆激酶活力，以確定最佳氮源。每個試驗重復3次，結果見圖4。

圖4 不同氮源對菌株產納豆激酶的影響

由圖4可知，不同氮源對納豆激酶的產生有很大的影響，4種氮源的產酶量差距很大，以酵母浸粉為最高，達到1115U/mL，大豆蛋白胨其次，胰蛋白胨最低。酵母浸粉是微生物源的培養基成分，相比于動植物源蛋白胨和大豆蛋白胨，可能更易于微生物的吸收利用。故選取酵母浸粉為最佳氮源。

2.3.2 最適碳源的優化 由圖5可知，4種碳源均適宜菌種的發酵，產酶量都較高，單糖葡萄糖和木糖的產酶量相當，二糖蔗糖和麥芽糖的產酶量相當；但以二糖為碳源時BSNK-5的產酶量較單糖的產酶量高，而兩種二糖中以麥芽糖為碳源時菌種產酶量最高，達到986U/mL，與李文亮等［15］的研究一致，且麥芽糖的價格比較適宜，來源比較廣泛，適宜工業化生產，故碳源采用麥芽糖為最佳。

2.3.3 培養條件對產酶量的影響 本研究在確定了最佳氮源和碳源的試驗基礎上設計6因素5水平的完全隨機正交試驗，考察不同濃度的氮源和碳源，不同起始pH的發酵培養液，不同接種量、培養溫度和發酵時間對BSNK-5發酵產納豆激酶的影響。正交試驗設計見表1，試驗結果見表2。

圖5 不同碳源對菌株產納豆激酶的影響

表1 正交試驗設計簡表

由表2可知酵母浸粉和麥芽糖的百分含量，發酵培養基的起始pH值，菌種接種量，培養溫度，發酵時間對BSNK-5液體發酵產納豆激的量有明顯影響。25個平行試驗中有2個試驗結果是相同的，酶活最高達到1160U/mL，這兩個最佳的液體發酵培養條件分別為：（1）2％的酵母浸粉、3％的麥芽糖、最適pH為6.5、接種量為5％、培養溫度為30℃、培養時間為60h；（2）2.5％的酵母浸粉、2％的麥芽糖、最適pH為7.5、接種量為3％、培養溫度為30℃、培養時間為72h。

3 討論

納豆激酶突出的生物學功能，特別是在血栓溶解方面的優勢使其成為了當今研究的熱點。目前關于納豆激酶的研究主要是提高該酶的產量，主要途徑集中于以下幾個方面。

首先，篩選納豆激酶高產菌株。自從1987年Sumi等［1］第一次在納豆食品中發現了納豆激酶以來，人們相繼在一些海洋生物［14］，如skipjack shiokara［17，18］，日本納豆［5］，韓國的hungkook-jang soy sauce［19，20］，Doen-jang［21］，臺灣土壤［22］，中國的豆豉［2，23］和亞洲發酵蝦醬［24］中分離到了納豆激酶生產菌。為了得到更多優勢菌株，人們仍在不同的產品和環境中篩選納豆激酶生產菌株。

表2 正交試驗結果

其次，通過物理或化學方法誘變選育納豆激酶高產菌株。夏麗等［25］通過紫外線直接照射涂菌蛋白平板，篩選到一個高產突變株，其纖溶活性比出發菌株提高了8.81％。關志偉等［26］通過鹽酸羥胺和紫外線復合誘變獲得一株高產納豆激酶突變株，其產酶活性比野生菌提高了68％。劉新梅等［27］通過對納豆菌原生質體紫外誘變得到一株高產納豆激酶菌株，其發酵液的酶活力比誘變前提高了74.5％。

再者，對納豆激酶生產菌發酵條件優化提高納豆激酶的產量。優化培養基組成和發酵工藝，可以明顯提高芽孢桿菌的納豆激酶產量［9-11］。研究發現，液體發酵培養基的氮源、碳源及其百分含量，液體發酵培養基的pH值，菌種接種量，培養溫度，發酵時間等各個因素都會明顯影響納豆芽孢桿菌的生長狀態，從而影響到酶的產量。芽孢桿菌在營養缺乏或不適的環境極易形成芽孢，進入休眠狀態，從而停止產酶，這也是芽孢桿菌在實際生產應用中的一個瓶頸。

本研究對實驗室分離的納豆激酶高產菌株BSNK-5進行鑒定，結合形態學觀察確認為枯草芽孢桿菌屬菌株。對BSNK-5發酵產納豆激酶的各個因素進行了初步的探討研究，通過優化該菌株發酵過程中的發酵培養基的氮源、碳源及其百分含量，液體發酵培養基的pH值，菌種接種量，培養溫度和發酵時間，盡量使菌株處于最適生長環境，提高納豆激酶的產量。試驗結果也進一步證實在優化條件下，BSNK-5的納豆激酶產量明顯提高，高達1160U/mL。與之前相比（發酵條件優化前BSNK-5的納豆激酶酶活力為303U/mL），活性提高到283％。

4 結論

通過形態學觀察和分子鑒定，BSNK-5為枯草芽孢桿菌屬菌株。對影響BSNK-5液體發酵產納豆激酶的不同因素進行了初步探討研究。由液體發酵產酶的單因素和正交試驗結果表明納豆激酶的最佳產酶條件為：（1）2％酵母浸粉，3％麥芽糖，0.6％Na2HPO4，0.1％ NaH2PO4，0.05％ MgSO4，0.02％CaCl2，pH6.5，接種量為5％，30℃發酵培養60h；（2）2.5％酵母浸粉，2％麥芽糖，0.6％Na2HPO4，0.1％NaH2PO4，0.05％ MgSO4，0.02％ CaCl2，pH7.5，接種量為3％，30℃發酵培養72h。在最適產酶條件下納豆激酶的活性為1160U/mL，是之前的283％。

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