藤茶抗氧化活性研究

歐賢紅，葉 勇 ，黃秋潔，劉華鋼，宋云飛

1瀘州醫學院，瀘州 646000;2桂林醫學院藥學院，桂林 541004;3廣西醫科大學藥學院，南寧 530021;4桂林萊茵生物科技股份有限公司博士后工作站，桂林 541100;5廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530001

藤茶系葡萄科蛇葡萄植物顯齒蛇葡萄［Ampelopsis grossedntata(Hand-Mazz)W.T.Wang］的莖葉，該植物總黃酮含量豐富［1］。研究表明［2］，黃酮類化合物的抗衰老、抗突變、抗動脈粥樣硬化等作用都與其抗氧化活性有關。藤茶總黃酮具有較強的抗氧化活性，可清除氧自由基，并能預防性對抗超氧陰離子自由基引起的氧化性損傷［2，3］。藤茶黃酮類化合物包括楊梅素、二氫楊梅素、福建茶素、楊梅黃素、楊梅苷等，其中二氫楊梅素含量較高［1］。據報道［3，4］，楊梅素和二氫楊梅素清除DPPH·的活性均強于蘆丁，其中二氫楊梅素的抗氧化活性還強于Vit C和常用的人工合成抗氧化劑叔丁基對苯二酚(TBHQ)。張曉元等［5］采用ESR和自旋捕集技術測定二氫楊梅素對·OH、和DPPH·的清除效果。結果表明，二氫楊梅素清除自由基的能力是＞DPPH·＞·OH。該研究結果與徐靜娟等［6］采用氮藍四唑(NBT)光化還原法、抗壞血酸-Cu2+-H2O2體系法和亞油酸體系法的研究結果一致。此外，二氫楊梅素對動物油和植物油均有很強的抗氧化作用。而楊梅素無論對水溶性食品或脂溶性食品，均能發揮很好抗氧化作用，作用明顯強于合成抗氧化劑3，5-二叔丁基-4-羥基甲基苯(BHT)和蘆丁［7］。因此，二氫楊梅素和楊梅素可作為天然抗氧劑應用于食品保藏。

以往研究楊梅素和二氫楊梅素的抗氧化活性大多采用紫外分光光度法［4，6，7］。對藤茶總黃酮、楊梅素和二氫楊梅素在DPPH·、氧自由基()和羥自由基(·OH)體系中的抗氧化活性尚未見報道。因此，為進一步明確藤茶不同提取物藤茶總黃酮、二氫楊梅素和楊梅素的抗氧化活性，本文采用酶標儀法檢測了藤茶總黃酮、二氫楊梅素和楊梅素對·OH、O2-·和DPPH·的清除效果并，比較它們清除自由基的能力。

1 儀器與材料

1.1 儀器

酶標儀(型號VersaMax)。

1.2 藥品與試劑

藤茶總黃酮、二氫楊梅素和楊梅素(均為自制，含量分別為74%、90%、83%，以1%DMSO超聲溶解成適宜濃度備用;DPPH·樣品(Sigma公司);鄰苯三酚、硫酸亞鐵(FeSO4)、乙醇、鹽酸(HCl)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰二氮菲(均為分析純)。

2 實驗方法

2.1 DPPH·體系

［8］，并稍作改進:取0.5 mL不同濃度樣品液于離心管中，加入0.5 mL 0.08 mg/mL的DPPH·溶液(準確稱取20 mg DPPH·，加60%乙醇溶解于小燒杯中，移至250 mL容量瓶，定容)，混勻，取200 μL置于96孔板中，共3孔，靜置30 min，于517 nm處測定吸光度Ai;同時測定0.5 mL DPPH·溶液與0.5 mL 60%乙醇混合溶液的吸光度Ac;0.5 mL提取液與0.5 mL 60%乙醇混合溶液的吸光度Aj。采用維生素C(Vit C)作為陽性對照藥按照同法進行測試。根據以下公式計算抑制率:抑制率={1-(Ai-Aj)/Ac}×100%，抑制率越大，則表示該試樣的抗氧化活性越強。實驗重復3次。

2.2 ·OH 體系［9］

取0.1 mL 7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液置于1 mL離心管中，加入0.2 mL 0.2 mol/L pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液(PBS)，混勻后加入 0.1 mL 7.5 mmoL/L 的FeSO4溶液，充分混勻后加入0.1 mL 0.1%H2O2溶液，然后加雙蒸水補足到1 mL，混勻，取200 μL置于96孔板中，共3孔，在37℃水浴下反應1 h后，以536 nm波長下測定吸光度A(損害)。同上法，不加入H2O2和樣品溶液測定A(未損害)。方法同2.1，分別加入不同濃度的樣品溶液0.1 mL后加H2O2，測536 nm時的吸收值，即得 A樣。重復3次。采用等濃度的Vit C作為陽性對照藥按照同法進行測試。按下式計算·OH清除率:·OH清除率(S%)=(A樣-A損害)/(A未損害-A損害)×100%。

取 2.7 mL PBS(pH 8.2)，加0.2 mL 蒸餾水，鄰苯三酚0.1 mL。混勻，于25℃保溫，4 min后加入10 mol/L HCl一滴終止反應。取200 μL置于96孔板中，共3孔，于325 nm處測吸光度A0。測定樣品清除能力時，取2.7 mL PBS，加0.2 mL 不同濃度的樣液，0.1 mL的鄰苯三酚，混勻于25℃保溫，4 min后加入10 mol/L HCl一滴終止反應。于325 nm處測吸光度Aj。采用等濃度的Vit C作為陽性對照藥按照同法進行測試。清除率計算公式:S=［1-(Aj-Ai)/A0］×100%，Ai為樣液吸光度。實驗重復3次。

2.4 數據統計方法

3 實驗結果

3.1 對DPPH·的清除活性

以水溶性抗氧化劑Vit C作對照，研究了藤茶總黃酮、二氫楊梅素、楊梅素對DPPH·的清除作用，結果見圖1。由圖1可知，藤茶總黃酮、二氫楊梅素、楊梅素對DPPH·具有很明顯的清除作用，三者的清除效果均比同濃度的Vit C效果好，且呈量效關系。由表1可以看出，藤茶總黃酮、二氫楊梅素、楊梅素清除DPPH·的IC50值為均大于Vit C，其中楊梅素的IC50值比藤茶總黃酮、二氫楊梅素的小，提示楊梅素的清除DPPH·效果優于藤茶總黃酮、二氫楊梅素。

圖1 藤茶不同提取物對DPPH·的清除作用Fig.1 DPPH· scavenging activities of different extracts of A.grossedntata

3.2 對·OH的清除活性

由圖2可知，在10～80 mg/L濃度范圍內，藤茶各提取物的抗氧化活性大小為:楊梅素＞二氫楊梅素＞藤茶總黃酮＞Vit C。但在200～400 mg/L濃度范圍內藤茶各提取物對·OH的清除活性弱于Vit C。

圖2 藤茶不同提取物對·OH的清除作用Fig.2 ·OH scavenging activities of different extracts of A.grossedntata

3.3 對 O2-· 的清除活性

如圖3和表1所示，藤茶不同提取物藤茶總黃酮、楊梅素和二氫楊梅素清除的作用明顯強于Vit C，且二氫楊梅素的清除作用優于藤茶總黃酮和楊梅素，其 IC50為3.88 ±0.99 mg/L。

圖3 藤茶不同提取物對·的清除作用Fig.3 ·scavenging activities of different extracts of A.grossedntata

表1 藤茶不同提取物的抗氧化活性(，n=3)Table 1 Antioxidant activities of different extracts of A.grossedntata(，n=3)

表1 藤茶不同提取物的抗氧化活性(，n=3)Table 1 Antioxidant activities of different extracts of A.grossedntata(，n=3)

注:與Vit C比較，1)P ＜0.05;與藤茶總黃酮比較，2)P ＜0.05;與二氫楊梅素比較，3)P ＜0.05;“-”無法計算IC50Note:Compare with Vit C，1)P ＜0.05;Compare with total flavonoid，2)P＜0.05;Compare with dihydromyricetin，3)P ＜0.05;“ － ”IC50cannot be calculated

IC50(mg/L)樣品Samples 體系System藤茶總黃酮 Total flavonoid 3.32 ±0.181) 5.22 ±3.751)DPPH·體系DPPH·System O-·2楊梅素 Myricetin 2.91 ± 0.281，2，3)5.02 ±0.091，3)二氫楊梅素 Dihydromyricetin 3.76 ±0.081) 3.88 ±0.991)Vit C Control 5.63 ±1.15 －

4 討論

藤茶總黃酮、楊梅素和二氫楊梅素具有較強的抗氧化活性。藤茶總黃酮清除黃嘌呤(黃嘌呤氧化酶系統產生的的 IC50為 14.7 mg/L［3］。在 0.5～10.0 mg/mL范圍內，藤茶總黃酮的抗活性氧能力呈量效關系，70 mg/mL藤茶總黃酮的抗氧化能力超過維生素E和Vit C［2］。本文采用鄰苯三酚自氧化法測得藤茶總黃酮清除的 IC50為(5.22 ±3.75)mg/L，在1.0 ～20.0mg/L 范圍內，對的抑制率高于同等濃度的Vit C，并呈量效關系。此外，本文結果顯示藤茶總黃酮清除DPPH·的IC50為 (3.32±0.18)mg/L，在2.0 ～ 10.0 mg/L 范圍內，對 DPPH·的抑制率高于同等濃度的Vit C，并呈量效關系;在10 ～200.0 mg/L范圍內，對·OH的抑制作用呈量效關系，其抑制率高于同等濃度的Vit C。據報道［3，4］，楊梅素和二氫楊梅素清除 DPPH·的 IC50值分別為 18.34、10.70 μg/mL，它們的抗氧化活性均強于陽性藥蘆丁(IC50=31.32 μg/mL)，其中二氫楊梅素還強于Vit C和常用的人工合成抗氧化劑叔丁基對苯二酚(TBHQ)。但是，本實驗測得楊梅素和二氫楊梅素清除 DPPH·的 IC50值分別為(2.91 ±0.28)、(3.76 ±0.08)mg/L，它們的抗氧化活性均強于陽性藥Vit C。張曉元等［5］采用ESR和自旋捕集技術測定二氫楊梅素對·OH、和DPPH·的清除效果。結果表明，二氫楊梅素清除、·OH 和 DPPH·的 IC50分別為 7.4、297.8 和 12.4 μg/mL，表明二氫楊梅素對的清除作用更強。該研究結果與徐靜娟等［6］采用NBT光化還原法、抗壞血酸-Cu2+-H2O2體系法和亞油酸體系法的研究結果一致(二氫楊梅素對不同自由基的清除能力是O2-·＞·OH＞脂過氧自由基ROO·)。為進一步明確藤茶不同提取物藤茶總黃酮、二氫楊梅素和楊梅素的抗氧化活性，我們采用酶標儀檢測了藤茶總黃酮、二氫楊梅素和楊梅素對·OH、和DPPH·的清除效果并比較它們清除自由基的能力，結果二氫楊梅素對DPPH·和的清除作用強于·OH，楊梅素對不同自由基的清除能力是DPPH·＞＞·OH;不同藤茶提取物對清除能力是二氫楊梅素＞楊梅素＞藤茶總黃酮，對·OH清除能力是楊梅素＞二氫楊梅素＞藤茶總黃酮，對DPPH·清除能力是楊梅素＞藤茶總黃酮＞二氫楊梅素。是生成其它活性氧自由基的前體，清除就意味著能控制其它活性氧自由基的形成［10］，因此，本文實驗結果提示楊梅素和二氫楊梅素是藤茶總黃酮中主要抗氧化活性成分。

二氫楊梅素對動物油和植物油均有很強的抗氧化作用。楊梅素無論對水溶性食品(飲料、冷飲、維生素C)或脂溶性食品(食用油脂、乳脂、人造奶油、蛋黃醬、維生素D)，均能發揮很好抗氧化作用，特別在護色、防止油脂酸敗和香氣劣化等方面，具有很強優越性，作用明顯強于合成抗氧化劑3，5-二叔丁基-4-羥基甲基苯(BHT)和蘆丁［7］。因此，二氫楊梅素和楊梅素可作為天然抗氧劑應用于食品保藏。但是，二氫楊梅素在藤茶中含量高，且廣泛存在于多種藥食同源的植物中，提取方法簡單［1］，比楊梅素更易獲得，因此二氫楊梅素比楊梅素更具經濟開發價值。

本文明確了二氫楊梅素、楊梅素的抗氧化作用，今后將進一步研究它們的抗氧化作用機制。

參考文獻

1 Zhang YS(張友勝)，Yang WL(楊偉麗)，Xiong HP(熊皓平)，et al.Basic constituent of Ampelopsis Grossedentat.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2001，13:46-48.

2 Tang Y(唐瑛)，Sui ZY(歲祖友)，Yan FW(嚴奉偉).Antioxidative effect of total flavonoids from Ampelopsis Grossedentata(AGTF)in vitro.China Pharm(中國藥師)，2006，9:716-718.

3 He GX(何桂霞)，Du FM(杜方麓)，Yang WL(楊偉麗)，et al.Effects of tengcha flavonoids on scavenging oxygen free radicals and inhibiting lipid-peroxidation.J Chin Med Mat(中藥材)，2003，26:338-340.

4 Zhao L(趙麗)，Xu SP(徐淑萍)，Li ZY(李宗陽)，et al.Study on the antioxidant and antiacetylcholinesterase activities of myricitrin and its structure-similar compounds.Sci Tech Food Ind(食品工業科技)，2012，33:56-59.

5 Zhang XY(張曉元)，Wu H·吳暉)，Lin X(林霞)，et al.Scavenging effect of dihydromyricetin on the free radicals by ESR.Mod Food Sci Tech(現代食品科技)，2010，26:1040-1042.

6 Xu JJ(徐靜娟)，Yao MJ(姚茂君)，Xu G(許鋼)，et al.Study on antioxidate activities of dihydromyricetin.Food Sci(食品科學)，2007，28:43-45.

7 Lin GT(凌關庭).Chinese bayberry extract and its antioxidant effect.Cereals Oils(糧食與油脂)，2009，4:38-41.

8 Chen H(陳瀚)，Li J(李進)，Li X(李祥)，et al.Antioxidation of different extracts from Isatidis indigotica in vitro.Chin J Exp Trad Med Form(中國實驗方劑學雜志)，2012，18:184-186.

9 Li SQ(李時琪)，Chen CY(陳朝銀)，Zhao SL(趙聲蘭)，et al.Studies on antioxidant in vitro of polysaccharide from different molecular weight fructus Gleditsiae abnormalis.Chin J Exp Trad Med Form(中國實驗方劑學雜志)，2012，18:145-149.