HF-LPME-UHPLC-MS同時分析金銀花中三種黃酮成分的含量

李 偉，王伯初，楊 憲

重慶大學生物工程學院，重慶 400030

金銀花味甘，性寒。功能清熱解毒、涼血散風，主治風熱感冒、溫病發熱等癥［1］。金銀花主要化學成分有苷類、有機酸類、揮發油和黃酮類等［2］。常以綠原酸為主要提取物，近年來，金銀花黃酮類化合物的抗菌作用及其他生物學活性逐漸引起人們的重視，如唐敏等［3］研究發現，金銀花黃酮類物質具有的抗菌活性優于綠原酸。為了更好的對金銀花中黃酮類物質進行質量控制，需要一種優秀的前處理方法。中空纖維液相微萃取技術［4］(hollow fibre-based liquid-phase microextraction，HF-LPME)是一新興的前處理技術，利用有機溶劑在中空纖維壁形成液膜，同纖維腔、纖維外溶液形成三相的萃取系統，具有裝置簡單，同時可進行純化富集以及便于同液質聯用的優點，廣泛應用于環境科學、食品檢測等領域［5-7］。本實驗建立了以HF-LPME作為前處理方法，UHPLC-MS作為檢測手段，實現對三種黃酮類成分的檢測。該方法富集倍數高、靈敏度好、檢測限低。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Acquity(UPTM)Ultra Performance LC串聯XE MICROMASS(Waters，USA)超高壓液相色譜-質譜聯用儀;Quattro Accurel Q 3/2聚丙烯中空纖維 (Membrana，Wuppertal，Germany);800B 型離心機(上海安亭科學儀器廠);78-2型雙向磁力架勢攪拌器(江蘇中大儀器廠);SHZ-M型真空泵(鞏義市英峪儀器廠，中國)。

1.2 材料

金銀花由重慶奇仙中藥材開發有限公司生產，產地山東，生產批號110701，購于重慶市西部大藥房。

1.3 試劑

甲醇、甲酸 (Merck公司，色譜純);磷酸、丙酮、乙酸乙酯、正辛醇、三氯甲烷(重慶川東化學試劑有限公司，分析純);對照品均為中國藥品生物制品檢定所提供;實驗用水為雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜、質譜條件

色譜條件:色譜柱，Waters BEH C18(50 mm ×2.1 mm，1.7 μm)，流動相，甲醇 (A)和 0.1% 甲酸水溶液 (B)，流速0.2 mL/min;梯度洗脫，即30%A保持3 min，在3 min內由30%A線性增加至40%A并保持2 min，隨后在1 min內再從40%A線性增至80%A并保持5 min，最后在1 min內由80%A線性回落到起始的30%A并保持5 min。進樣量4 μL;柱溫30℃。

質譜條件:ESI源;源電壓:3.5 kV;錐孔電壓:30 V;正離子檢測，［M+H］+作為定量離子［8］;去溶劑氣和錐孔反吹氣流速分別為700 L/h和50 L/h，氣體為高純N2;碰撞氣流速為0.18 mL/min，維持碰撞池壓力為334 Pa，毛細管溫度350℃;毛細管電壓維持在15-50 V。采用全離子掃描方式，掃描范圍m/z 100～1000。

等梯度洗脫流動相體系為甲醇∶水(50∶50);得標準溶液的MS-TIC譜圖(圖1A)和代表樣品譜圖(圖1B)。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品適量，溶于80%甲醇中，制備59.27 μg/mL 蘆丁，65.51 μg/mL 金絲桃苷，82.22 μg/mL槲皮素的對照品儲備液，4℃保存，備用。

圖1 三種黃酮化合物對照品UHPLC-MS總離子流圖(A)和金銀花提取液UHPLC-MS總離子流圖(B)，(1)蘆丁;(2)金絲桃苷;(3)槲皮素Fig.1 UHPLC-MS total ion chromatograms of mixed standard solution(A)and L.japonica sample(B)，(1)rutin，(2)hyperin，(3)quercetin

2.3 供試品溶液制備

精確量取0.1 g粉碎后金銀花樣品，置具塞錐形瓶中，加甲醇100 mL。稱重后，加熱回流1 h，冷卻至室溫。稱重，并用甲醇補足溶液缺失。搖勻后離心，取1.0 mL上清液，氮氣吹干后，溶解于5 mL的0.05 mol/L KH2PO4(pH 3.0)溶液，作為供試品溶液。

2.4 HF-LPME工藝參數的考察

蘆丁、金絲桃苷屬黃酮苷類化合物，槲皮素屬黃酮醇類化合物，選取蘆丁、槲皮素，代表3個黃酮成分，以萃取率(R)和富集倍數(EF)為指標，進行工藝參數的考察。

na:接收相中各黃酮成分的摩爾數;ns:供出相中各黃酮成分的摩爾數;

va接收相的體積;vs供出相的體積;

ca:接收相中各黃酮成分的濃度;cs:供出相中各黃酮成分的濃度;

2.4.1 中空纖維材料的選擇

考察了聚砜和聚丙烯兩種材料，結果發現，聚砜材料的中空纖維對有機膜的粘度不夠，液膜發生破裂，而聚丙烯中空纖維對于兩種黃酮類化合物的萃取效果均最好，故選用聚丙烯中空纖維作為有機溶劑的載體。

2.4.2 有機溶劑的選擇

考察了正丁醇、三氯甲烷和乙酸乙酯三種有機溶劑，蘆丁、槲皮素的萃取效率同其在UHPLC-MS譜圖中的峰面積正相關，結果(如圖2)表明三氯甲烷和乙酸乙酯作為有機萃取劑對黃酮的萃取效果最好，但考慮到三氯甲烷揮發性強，故選用乙酸乙酯作為萃取劑，貼纖維壁形成萃取層。

圖2 三種溶劑對兩種黃酮成分的萃取效率Fig.2 The extraction efficiency of three solvents

2.4.3 磁流體加入量的選擇

磁流體粉末加入量過大，會增加體系粘度影響傳質的進行，但加入量過小，達不到理想的攪拌效果。以富集倍數作為指標，從圖3可知，加入磁流體份的最佳值為0.25 g。

圖3 納米磁流體加入的量同富集倍數之間的關系Fig.3 Effect of magnetic powder on HF-LPME efficiency

2.4.4 萃取時間的選擇

萃取時間越長，萃取效率越高，但同時有機液膜可能揮發破損。以富集倍數為考察指標。從圖4可知，在萃取50 min后富集倍數達到最大。

圖4 萃取時間與富集倍數直接的關系Fig.4 Effect of extraction time on HF-LPME efficiency

2.4.5 環境pH的考察

給出相和接收相的酸堿度直接影響目標物質的萃取效率(如圖5、6)，根據實驗結果所示，選擇pH 3.0的 KH2PO4作為給出相，pH 8.5 的 NaHCO3溶液作為接收相。

綜上，得到HF-LPME的工藝條件:把中空纖維切為約8 cm的小段，丙酮超聲清洗20 s，重復3次，晾干。之后浸入乙酸乙酯，超聲10 s，使纖維壁形成有機層，中空纖維一端接內含20 μL NaHCO3緩沖液(pH為8.5，10 mmol/L)的微量進樣器。將緩沖液緩緩推入中空纖維，封閉另一端，固定樣品于交變磁場，攪拌萃取50 min，轉速1000 rpm，從進樣器中回收接收相，氮氣吹干，用20 μL的80%甲醇溶解，取4 μL進行UHPLC-MS測定。

2.5 線性關系、檢測限考察

精密量取對照品儲備液0.01(a)、0.02(b)、0.04(c)、0.08(d)、0.20(e)、0.40(f)、1.00(g)和2.00(h)mL至100 mL容量瓶中，用80%甲醇溶液定容。檢測蘆丁線性關系采用濃度為c～h的六種稀釋濃度;檢測金絲桃苷采用濃度為b～h七種;檢測槲皮素為a～h八種。分別進樣4 μL，以質量濃度對峰面積平均值回歸，得回歸方程。

分別取對照品貯備液，用甲醇-0.1%甲酸溶液(30∶70)依次稀釋系列溶液并進樣分析，測定峰面積約為噪音3倍(S/N≥3)時的進樣質量濃度為檢測限 (LOD)。

結果如表1，發現在線性范圍內相關系數和檢測限良好。

表1 線性關系、檢測限結果Table 1 Linear relationship and LOD of rutin，hyperin and quercetin

2.6 精密度試驗

精確取混合對照液，配成 1.00、0.10 和 0.01 μg/mL的標準溶液，處理后檢測，各個濃度平行操作5次，日內精密度RSD內＜5.0%;連續測定3日得日間精密度RSD間＜6.7%。

2.7 HF-LPME富集倍數和萃取回收率的計算

取6份供試品，根據接收相和給出相中三種黃酮物質的濃度比，可得富集倍數;據接收相中三種待測物的摩爾數和給出相中三種待測物的摩爾數之比，可以得萃取回收率;計算得出，蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的富集倍數分別為38、42、83倍，萃取回收率分別為 95.34%、95.17%、99.83%，RSD 分別為1.8%、1.3%和 2.2%。

2.8 樣品測定

分別檢測6批供試品，每批平行3份，依上述色譜條件進行測定，結果見表2。

表2 金銀花中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的測定結果(n=3)Table 2 Quantification results of rutin，hyperin and quercetin in L.japonica(n=3)

3 討論

HF-LPME同其他前處理技術相比，有以下優勢:

①成本較低。基本裝置組成是微量進樣器(25 μL)、小段多孔中空纖(7～8 cm)、西林瓶(5 mL)和磁力攪拌裝置;②具有優秀的富集倍數，檢測時需要的樣品溶液量很少，在貴重藥質量控制中具有很大的優勢;同時，運用的有機溶劑較少，僅是纖維掛壁用量，因此相比其他前處理方式，對環境的影響可忽略;③更適合同色譜技術聯用。由于中空纖維孔徑為0.2 μm，在富集的同時又有凈化的作用，供試品從HF-LPME裝置取出后，可直接進樣分析;④有多種模式可供選擇，可以同供試品性質結合，達到最優化組合。如按是否攪拌分為動態、靜態模式;按溶劑的種類分為兩相、三相模式;⑤不存在交叉污染的問題，因使用的中空纖維較為廉價，一般使用后做丟棄處理，在進行連續處理多個樣品時，不會因為交叉污染而影響痕量分析的結果。

同文獻［9］相比，可以發現UHPLC-MS對金銀花樣品進行檢測，可有效縮短色譜保留時間(三種黃酮類物質的保留時間分別從 10.88、14.68、24.74 min 縮短到 2.5、4.0、10.0 min)，HF-LPME-UHPLCMS可以降低檢測限(從量級μg/mL降低至μg/L)及提高回收率(最低值85.4% 提高至95.3%)。

本研究建立了利用HF-LPME作為UHPLC-MS/MS的前處理技術，檢測金銀花中的三種黃酮類物質的含量，該法具有操作簡便、集純化濃縮為一體的特點，能夠應用于金銀花中黃酮類物質的檢測。

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