虎皮楠內(nèi)生真菌Aspergillus sp.DCS31化學(xué)成分研究

孟欣欣，葛 鋒，曾 英，趙沛基*

1昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500;2中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，昆明 650204

長序虎皮楠(Daphniphyllum longeracemosum)為虎皮楠科(Daphniphyllaceae)虎皮楠屬(Daphniphyllum)植物，在我國主要分布于云南東南部和廣西，是一種生于海拔1000～1800 m密林中的常綠喬木［1，2］。虎皮楠科植物在傳統(tǒng)中藥中具有一定的藥用價值，具有愈合、消炎等作用［3］。其代謝產(chǎn)物中含有大量的虎皮楠生物堿，該類生物堿多變的結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的多環(huán)骨架，成為化學(xué)和生物合成的熱點之一。

植物內(nèi)生真菌是指在某一時期生活在植物體內(nèi)，但對寄主植物組織并不引起明顯病害癥狀的真菌［4］。內(nèi)生真菌長期與藥用植物共同相互共生，有可能產(chǎn)生與宿主相同或相似生理活性的化學(xué)成分［5］。為了進一步尋找新型的天然產(chǎn)物及活性物質(zhì)，我們對一株分離自長序虎皮楠韌皮部的內(nèi)生真菌的化學(xué)成分進行研究，從內(nèi)生真菌Aspergillus sp.DCS31的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中分離得到五個化合物，分別為 asperpyrone D(1)、asperpyrone A(2)、flavasperone(3)、1，2-benzene dicarboxylic acid bis(2αmethyl heptyl)ester(4)、2，5-dihydroxyphenylacetic acid methyl ester(5)。化合物1～4為首次從虎皮楠內(nèi)生真菌中分離得到。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Bruker AM-400型核磁共振儀;DRX-500型核磁共振儀;Avance III 600型核磁共振儀;Finnigan LCQ-Advantage型質(zhì)譜儀;薄層層析用硅膠板和柱層析硅膠G，200～300目(青島海洋化工廠)，柱層析硅膠H(Merck公司);Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(Amersham Pharmacia公司)。

Aspergillus sp.DCS31分離來自長序虎皮楠(Daphniphyllum longeracemosum)的樹皮韌皮部。長序虎皮楠采自2009年移栽于昆明植物園的植物。

1.2 內(nèi)生菌的鑒定

Aspergillus sp.DCS31的總DNA根據(jù)文獻采用肌氨酸鈉法提取［6］。實驗中所用的ITS 4與ITS 5引物是真菌系統(tǒng)學(xué)研究中設(shè)計的通用引物ITS 4(5'＞TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC＜3')和ITS 5(5'＞GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G ＜3')。PCR程序為95℃預(yù)變性15 min(加酶);95℃變性40 s，55 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸 90 s，30 個循環(huán);72℃延伸10 min，PCR后回收到大約700 bp的核酸片段，測序后通過與GenBank數(shù)據(jù)庫比對來鑒定菌株。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，定容至1 L，pH 自然，121 ℃滅菌20 min。

培養(yǎng)條件:Aspergillus sp.DCS31經(jīng)PDA固體培養(yǎng)基發(fā)酵10 L，28℃培養(yǎng)14 d。

1.4 發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化

將長滿菌絲的固體培養(yǎng)基劃成小塊放于錐形瓶中，用乙酸乙酯:甲醇:冰醋酸 =(80∶15∶5，V/V/V)混合溶劑提取3次，所得提取液經(jīng)45℃減壓濃縮得到浸膏，將浸膏懸浮于蒸餾水后加入等體積的乙酸乙酯萃取至無色，最后得到提取物37 g。粗提物經(jīng)正相柱層析(200～300目)，分別用石油醚:丙酮(10∶1、9∶1、8∶2、7∶3)，氯仿:甲醇(20∶1、10∶1、9∶1、8∶2、7∶3)進行梯度洗脫，得到7個組分。組分2(215.5 mg)經(jīng)過反復(fù)的正相柱層析得到化合物3(6.0 mg)，組分4(4.0 g)經(jīng)過反復(fù)的正相柱層析和Sephadex LH-20柱分離得到化合物1(26.5 mg)、2(5.2 mg)、5(8.2 mg)，組分5(2.0 g)經(jīng)過反復(fù)的正相柱層析和Sephadex LH-20柱分離得到化合物4(31 mg)。

圖1 化合物1～5的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of compounds 1-5

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)生真菌的鑒定

Aspergillus sp.DCS31 的 5.8S rDNA 序列(Gen-Bank:JX025097)通過與GenBank數(shù)據(jù)庫序列比對，Aspergillus sp.DCS31與曲霉屬(Aspergillus)的同源性達99%，因此Aspergillus sp.DCS31鑒定為曲霉屬真菌。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 C31H24O10，黃色無定形粉末;ESI-MS m/z:557［M+H］+;1H NMR(C5D5N，600 MHz)δ:1.93(3H，s，CH3-2)，2.13(3H，s，CH3-2')，3.58(3H，s，OCH3-8')，3.78(3H，s，OCH3-6)，3.91(3H，s，OCH3-10')，6.05(1H，s，H-3)，6.12(1H，s，H-3')，6.64(1H，d，J=2.3 Hz，H-7')，6.90(1H，d，J=2.4 Hz，H-9')，7.26(1H，s，H-10)，7.61(1H，s，H-9);13C NMR(C5D5N，150 MHz)δ:185.0(s，C-4')，184.8(s，C-4)，168.4(s，C-2'/2)，163.8(s，C-5')，162.8(s，C-5)，162.3(s，C-8')，161.9(s，C-10')，160.6(s，C-6)，159.8(s，C-8)，153.5(s，C-10a)，151.8(s，C-10a')，141.7(s，C-9a)，141.6(s，C-9a')，118.4(s，C-7/6')，111.3(s，C-5a/4a')，109.2(d，C-5a')，107.5(s，C-3)，107.3(d，C-3')，106.5(s，C-9)，104.5(d，C-4a)，100.9(s，C-10)，97.5(d，C-7'/9')，62.3(q，OCH3-6)，56.1(q，OCH3-10')，55.1(q，OCH3-8')，20.2(q，CH3-2')，22.1(q，CH3-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致［7］，由于化合物1與相類似化合物NMR的數(shù)據(jù)差別很小，通過2D NMR進一步確定化合物1為asperpyrone D。

化合物2 C31H24O10，黃色無定形粉末;ESI-MS m/z:557［M+H］+;1H NMR(C5D5N，600 MHz)δ:1.96(3H，s，CH3-2')，2.24(3H，s，CH3-2)，3.62(3H，s，OCH3-6')，3.67(3H，s，OCH3-10)，3.92(3H，s，OCH3-8')，6.06(1H，s，H-3')，6.40(1H，s，H-3)，6.66(1H，d，J=2.2 Hz，H-7')，6.92(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，7.29(1H，s，H-6)，7.60(1H，s，H-7);13C NMR(C5D5N，150 MHz)δ:187.0(s，C-4')，185.2(s，C-4)，170.4(s，C-2')，169.4(s，C-2)，165.8(s，C-5')，164.4(s，C-6')，163.9(s，C-8')，162.5(s，C-8)，160.1(s，C-10)，159.1(s，C-5)，157.6(s，C-10b)，153.8(s，C-10a')，143.6(s，C-6a)，143.6(s，C-9a')，119.8(s，C-9)，112.7(d，C-3)，111.3(s，C-4a)，111.3(s，C-5a')，109.8(d，C-3')，109.5(s，10a)，108.5(d，C-7)，108.5(s，C-10a')，107.6(d，C-6)，106.7(s，C-4a')，99.4(d，C-9')，99.4(d，C-7')，63.4(q，OCH3-10)，58.1(q，OCH3-8')，57.1(q，OCH3-6')，22.2(q，CH3-2')，22.0(q，CH3-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致［8］。通過2D NMR進一步確定化合物2為asperpyrone A。

化合物3 C16H14O5，黃色無定形粉末;ESI-MS m/z:287 ［M+Na］+;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.28(1H，s，OH-6)，6.98(1H，s H-7)，6.60(1H，d，J=3.2 Hz，H-9)，6.41(1H，d，J=3.1 Hz，H-11)，6.02(1H，s，H-3)，4.02(3H，s，OCH3-10)，3.94(3H，s，OCH3-12)，2.39(3H，s，CH3-2);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:184.2(s，C-4)，167.4(s，C-2)，162.6(s，C-10)，161.5(s，C-6)，160.6(s，C-12)，153.3(s，C-14)，141.1(s，C-8)，108.4(s，C-13)，107.3(d，C-7)，104.3(s，C-5)，101.0(d，C-3)，97.8(d，C-9)，97.2(d，C-11)，56.1(q，OCH3-12)，55.4(q，OCH3-10)，20.7(q，CH3-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致［9］。

化合物4 C24H38O4，淡黃色油狀;ESI-MS m/z:391［M+H］+;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.71(2H，m，H-4，5)，7.54(2H，m，H-3，6)，4.26(4H，m，H-1'，1″)，1.70(2H，m，H-2'，2″)，1.25-1.45(16H，m，H-3'，3″，4'，4″，5'，5″，6'，6″)，0.93(6H，d，J=7.5 Hz，CH3-2'，2″)，0.90(6H，t，J=6.6 Hz，H-7'，7″);13C NMR(CD3Cl3，100 MHz)δ:167.63(s，C=O)，132.39(s，C-1，2)，130.76(d，C-3，6)，128.70(d，C-4，5)，68.07(t，C-1'，1″)，38.67(d，C-2'，2″)，30.29(t，C-4'，4″)，29.84(t，C-5'，5″)，23.68(t，C-6'，6″)，22.88(t，C-3'，3″)，13.91(t，C-7'，7″)，10.86(q，CH3-2'，2″)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致［10］。

化合物5 C9H10O4，無色油狀;ESI-MS m/z:183［M+H］+;1H NMR(CD3OD，600 MHz)δ:8.72(1H，s，OH-5)，8.64(1H，s，OH-2)，6.62(1H，d，8.6 Hz，H-3)，6.59(1H，d，2.9 Hz，H-6)，6.55(1H，dd，8.6，3.0 Hz，H-5)，3.67(3H，s，OCH3-8)，3.54(2H，s，H-7);13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ:174.7(s，C-8)，151.2(s，C-4)，149.7(s，C-2)，123.3(s，C-1)，118.7(d，C-6)，116.7(d，C-3)，115.8(d，C-5)，52.5(q，OCH3-9)，36.6(t，C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致［11］。

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