紅果參多糖的提取純化及抗氧化活性研究

陳莉華，龍進(jìn)國(guó)，譚林艷，廖 微

1吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;2吉首大學(xué)“植物資源保護(hù)與利用”湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉首 416000

紅果參屬桔梗科多年生草本植物，收載于《中國(guó)藥典》2010版一部［1］，別名蜘蛛果、山荸薺等，學(xué)名長(zhǎng)葉輪鐘草［Campnumoea lancifolia(Roxb.)Merr］，味甘而微苦，性平;具有補(bǔ)虛益氣、祛痰止痛等功效，主要用于治療跌打損傷、氣虛乏力、腸絞痛等，還可用于治療肺癆咳嗽、瘰疬、疝氣等。桔梗科植物大多具有野生習(xí)性，兼具藥用、食用、滋補(bǔ)和保健等功效，對(duì)該科黨參屬植物的研究較多，但未見(jiàn)對(duì)紅果參研究的相關(guān)報(bào)道。

天然多糖由于具有抗氧化、防衰老、抗腫瘤、降血糖等生物活性在食品和藥品開(kāi)發(fā)與利用方面已引起廣泛關(guān)注。從常見(jiàn)的植物如海金沙草［2］、蘆薈［3］、蘆筍［4］、野艾蒿［5］提取純化多糖的研究不斷見(jiàn)諸報(bào)道。國(guó)內(nèi)外目前已報(bào)道了200多種天然多糖［6］，其中95%以上為植物多糖，充分利用植物多糖的天然無(wú)毒性開(kāi)發(fā)各種功能性食品和保健品既順應(yīng)時(shí)代的發(fā)展又滿足了人類對(duì)天然產(chǎn)品返璞歸真的渴望。本文提取紅果參多糖，詳細(xì)研究其抗氧化活性，為紅果參綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器試劑與材料

Gzx-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);UV75TCRT紫外分光光度計(jì)(日本島津);K-201B-Ⅱ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);KQ-250E型超聲波清洗機(jī)(上海弗潤(rùn)茨機(jī)電系統(tǒng)有限公司);電子天平(上海維平科學(xué)儀器有限公司);恒溫箱(上海基瑋試驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司)。

樣品采于吉首大學(xué)“植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”紅果參基地、無(wú)水乙醇、KI、I2、冰醋酸、三氯甲烷、正丁醇、HCl、NaNO2、石油醚、Tris鄰苯三酚、FeSO4、H2O2、鹽酸萘乙二胺、氨基苯磺酸、淀粉、VC(抗壞血酸)、苯酚、濃硫酸、水楊酸等均為分析純;動(dòng)物油為市售新鮮豬板油熬制而成，金健牌茶籽油(植物油)購(gòu)于吉首本地超市。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅果參多糖的提取純化

紅果參果實(shí)—干燥箱中60℃干燥—粉碎—過(guò)篩—熱水超聲提取(80℃，液料比20 mL/g，45 min，三次)—過(guò)濾—濃縮—醇沉過(guò)夜(4倍體積無(wú)水乙醇)—離心干燥—粗多糖制品—溶解脫色(石油醚多次沖洗)—Sevage法除蛋白—上層液濃縮—醇沉過(guò)夜(4倍體積無(wú)水乙醇)—離心干燥—精多糖制品。

1.2.2 紅果參多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。

1.2.3 紅果參多糖清除羥基自由基

建立Fenton反應(yīng)體系模型［7］，以空白液為參比在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)其吸光值A(chǔ)0、Ax及Ax0，重復(fù)三次測(cè)定，按下式計(jì)算羥基自由基的清除率:

式中，A0為空白對(duì)照液吸光值;Ax為待測(cè)樣品液吸光值;Ax0為本底吸光值。

1.2.5 紅果參多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力測(cè)定

按照譚萍等［9］方法略有改變。量取pH為8.2的Tris-HCl緩沖液4.8 mL和1 mL不同濃度的待測(cè)液于10 mL試管中，置于25℃水浴中保溫20 min后立即加入0.3 mL 30 mmol/L的鄰苯三酚溶液，迅速搖勻后倒入比色皿中，用10 mmol/L的HCl溶液為空白液，在325 nm波長(zhǎng)處，每間隔30 s測(cè)吸光值一次，共反應(yīng)9 min;以吸光值A(chǔ)對(duì)反應(yīng)時(shí)間T作線性關(guān)系圖，斜率為V1，空白對(duì)照組以5 mL待測(cè)液代替樣品同樣測(cè)定，斜率為V2，按下式計(jì)算清除率:Y(%)=［1-V1/V2］ × 100，式中Y為清除率，V1和V2分別表示待測(cè)樣品和空白對(duì)照的吸光值隨時(shí)間的變化率。

1.2.6 紅果參多糖抑制油脂氧化能力的測(cè)定

在無(wú)水酸性條件下，油脂中的過(guò)氧化物使I-定量氧化成I2，I2與I-結(jié)合生成易溶于水的，利用的顏色與標(biāo)準(zhǔn)碘液進(jìn)行比較定量。按照文獻(xiàn)［10］的方法，在系列干燥的具塞25 mL比色管中，分別加入2∶3的氯仿—冰醋酸混合溶液7 mL，碘化鉀飽和堿液0.2 mL，每次加液后搖勻。再加蒸餾水5 mL，然后分別加入碘標(biāo)準(zhǔn)液 0.4、0.6、0.8、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mL。此相當(dāng)于每管含有 I2:40、60、80、120、140、160、180、200、220 μg。再加蒸餾水至刻度，加塞搖勻，靜置5～10 min，待分層后，取上清液移入l cm的石英比色皿中，以蒸餾水作參比，在353 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值A(chǔ)。根據(jù)所對(duì)應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用國(guó)際上通用的烘箱強(qiáng)化貯存法使油脂發(fā)生氧化酸敗變質(zhì)并求出過(guò)氧化值，測(cè)定多糖提取物、對(duì)照品加入前后油脂的過(guò)氧化值用于衡量其對(duì)油脂的抗氧化能力。稱取20 g油脂，加入2 mL提取物，攪拌均勻后，放入烘箱中強(qiáng)化保存1 h后，取待測(cè)樣品1 mL，加入2 mL氯仿-冰醋酸溶解，再加入1 mL 10%KI溶液，加蓋搖勻30 s，并置于暗處反應(yīng)3 min。取出后立即用水稀釋并加入1 mL 1%淀粉溶液，加塞，顛倒混勻2～3次，靜置5～l0 min，待水相澄清后，取上清液于1 cm石英比色皿中，在波長(zhǎng)353 nm處測(cè)吸光值，根據(jù)吸光值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算碘生成量。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，按下式計(jì)算油脂過(guò)氧化值(POV)及提取液對(duì)油脂的保護(hù)率:

式中:W表示油脂質(zhì)量/kg。

式中:η為提取液對(duì)油脂的保護(hù)率/%;

POV初為未對(duì)油脂進(jìn)行強(qiáng)化氧化時(shí)的過(guò)氧化值/(mmol/kg);

POV末1為添加紅果參多糖的油脂強(qiáng)化氧化后的過(guò)氧化值/(mmol/kg);

POV末2為未添加紅果參多糖的油脂強(qiáng)化氧化后的過(guò)氧化值/(mmol/kg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅果參多糖含量

以葡萄糖為對(duì)照品，490 nm下測(cè)得吸光值(A)與葡萄糖濃度(c)之間的回歸方程為:A=14.64c-7.86 ×10-3，R2=0.9973。葡萄糖質(zhì)量濃度在 0.01～0.06 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。將制得紅果參多糖溶解稀釋至一定濃度，按上方法測(cè)定紅果參多糖含量。用紅果參 32.9174 g，按 1.2.1提取得2.8611 g紅果參多糖，提取率達(dá)8.69%，紅果參多糖中葡萄糖含量為92.8%。

2.2 紅果參多糖對(duì)羥基自由的清除

按照實(shí)驗(yàn)方法，探究了不同濃度的紅果參多糖(PS)對(duì)羥基自由基的清除效果，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 紅果參多糖對(duì)羥基自由基的清除Fig.1 ·OH scavenging rates of Hong Guo Ginseng polysaccharide(PS)and ascorbic acid(VC)

羥基自由基(·OH)是已知的最活潑的活性氧自由基，也是毒性最大的氧自由基，清除羥基自由基可能是生物預(yù)防疾病的有效方式之一。由圖1可知紅果參多糖有很強(qiáng)的清除羥基自由基的作用，隨著質(zhì)量濃度的增加，紅果參多糖的清除能力依次增加。紅果參多糖和VC質(zhì)量濃度分別為0.30 mg/mL和0.14 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到50.00%。在相同質(zhì)量濃度下，小于0.12 mg/mL時(shí)，紅果參多糖清除·OH的能力大于VC，但大于0.12 mg/mL后，對(duì)照品VC的清除能力迅速上升，在0.35 mg/mL后，VC對(duì)羥基自由基的清除率接近100%，而紅果參多糖對(duì)清除率羥基自由基有明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系。

2.3 紅果參多糖對(duì)亞硝基的清除

按照實(shí)驗(yàn)方法，探究了不同濃度的紅果參多糖(PS)對(duì)亞硝基)的清除效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 紅果參多糖對(duì)亞硝基的清除Fig.2 scavenging rates of Hong Guo Ginseng polysaccharide(PS)and ascorbic acid(VC)

亞硝基是人體致癌的根源之一，對(duì)于亞硝基的清除是減少致癌的方法之一。由圖2可知紅果參多糖對(duì)亞硝基的清除作用不大，當(dāng)提取物中多糖質(zhì)量濃度達(dá)0.65 mg/mL時(shí)對(duì)亞硝基的清除仍沒(méi)超過(guò)10%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于VC的清除效果。

2.4 紅果參多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除

按照實(shí)驗(yàn)方法，探究了不同濃度的紅果參多糖(PS)對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 紅果參多糖對(duì)超氧陰離子的清除Fig.3 scavenging rates of Hong Guo Ginseng polysaccharide(PS)and ascorbic acid(VC)

2.5 紅果參多糖抗油脂氧化效果

在353 nm波長(zhǎng)下，I2含量(W/μg)對(duì)吸光值(A)的線性回歸方程為:A=0.00435W-0.24996，R2=0.9875。

按實(shí)驗(yàn)方法，探究了當(dāng)烘箱溫度60℃和強(qiáng)制放置時(shí)間1 h的條件下，不同質(zhì)量濃度的紅果參多糖(PS)對(duì)動(dòng)物油和植物油的抗氧化效果，結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。

由圖4可知，當(dāng)紅果參多糖(PS)作為抗動(dòng)物油氧化抑制劑時(shí)，在0.1 mg/mL時(shí)即達(dá)到最大保護(hù)率(58.80%)，而 VC 在 0.15 mg/mL 時(shí)達(dá)到最大保護(hù)率(55.03%)，隨后當(dāng)質(zhì)量濃度增大時(shí)，紅果參多糖的保護(hù)率緩慢下降而VC的保護(hù)率急速下降;由圖5可知，當(dāng)紅果參多糖作為抗植物油氧化抑制劑時(shí)，在0.1 mg/mL時(shí)即達(dá)到最大保護(hù)率(56.39%)，而 VC在0.15 mg/mL時(shí)達(dá)到最大保護(hù)率(98.24%)，隨后當(dāng)質(zhì)量濃度增大時(shí)，紅果參多糖和VC的保護(hù)率均急速下降。比較圖4和圖5可看出，在相同濃度下，紅果參多糖對(duì)動(dòng)物油的保護(hù)作用稍強(qiáng)于VC，對(duì)植物油的保護(hù)作用稍弱于VC，紅果參多糖對(duì)動(dòng)物油和植物油的保護(hù)作用大體一致，VC對(duì)動(dòng)物油的保護(hù)作用稍弱于植物油;但二者對(duì)動(dòng)物油和植物油的抗氧化能力變化趨勢(shì)大體相同，抗氧化能力先隨濃度成正相關(guān)，達(dá)到一定濃度后抗氧化能力隨濃度增加而降低。

3 結(jié)論

研究表明，紅果參多糖對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除和油脂的氧化抑制均有明顯作用。紅果參可進(jìn)行大面積人工種植，提取多糖工藝簡(jiǎn)單，作為一種新的天然、保健的綠色食品抗氧化劑具有良好的開(kāi)發(fā)前景。

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