亞硒酸鈉聯(lián)合長春新堿對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞的影響

唐士超 周達(dá)岸

結(jié)腸癌是一種常見的腫瘤疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康，但其發(fā)病機(jī)制不清，目前仍無有效治療手段。微量元素硒與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，結(jié)腸癌患者體內(nèi)常缺乏含硒化合物［1］，硒缺乏可能是結(jié)腸癌發(fā)生的重要機(jī)制之一。長春新堿在結(jié)腸癌的治療過程中發(fā)揮了重要作用，但副作用較為明顯，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用，積極探索長春新堿的配伍用藥，減少其用量具有重要臨床意義。因此，本文擬探討亞硒酸鈉與長春新堿聯(lián)合用藥對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的影響及機(jī)制，以期為結(jié)腸癌的臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫)，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司)，噻唑藍(lán)(MTT，南京建成生物工程研究所)，Cyclin D1蛋白抗體(Santa公司)，酶標(biāo)儀(北京普郎克公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 以1×104/孔的密度將HT-29細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)分組培養(yǎng)，對(duì)照組不添加處理因素(MDEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清)，亞硒酸鈉組含10 μmol/L亞硒酸鈉，長春新堿組含40 μg/L長春新堿，聯(lián)合給藥組含10 μmol/L亞硒酸鈉及40 μg/L長春新堿。

1.3 MTT法檢測(cè) HT-29細(xì)胞存活率 分組培養(yǎng)24、48、72 h后，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，96孔板每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，4 h后棄去培養(yǎng)液加入150 μl二甲亞砜并振蕩15 min，酶標(biāo)儀490 nm波長檢測(cè)各孔吸光度(A值)，細(xì)胞活力=檢測(cè)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.4 Western-blot檢測(cè) Cyclin D1蛋白表達(dá) 根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)細(xì)胞活力降低明顯時(shí)HT-29細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)。粉碎細(xì)胞后4℃ 12000 r/min離心15 min，測(cè)定并調(diào)節(jié)上清蛋白濃度，SDS-PAGE電泳蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以Cyclin D1蛋白及β-actin一抗室溫下分別孵育2 h，再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，利用ECL發(fā)光試劑盒顯影。以β-actin為內(nèi)對(duì)照，觀察Cyclin D1蛋白表達(dá)變化。

2 結(jié)果

2.1 亞硒酸鈉及長春新堿對(duì)HT-29細(xì)胞活力的影響 MTT實(shí)驗(yàn)顯示，亞硒酸鈉及長春新堿均可抑制HT-29細(xì)胞活力，聯(lián)合用藥效果更為顯著。分組72 h后HT-29結(jié)腸癌存活率降低最為顯著，因此本研究檢測(cè)了分組72 h后Cyclin D1蛋白表達(dá)變化(表1)。

表1 亞硒酸鈉及長春新堿對(duì)HT-29細(xì)胞活力的影響(n=6/組)

2.2 亞硒酸鈉及長春新堿對(duì)HT-29細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)顯示，亞硒酸鈉及長春新堿均可下調(diào)HT-29細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)，且聯(lián)合用藥Cyclin D1蛋白表達(dá)降低更為明顯(圖1)。

圖1 Cyclin D1蛋白表達(dá)變化

3 討論

結(jié)腸癌是一種臨床常見病多發(fā)病，在40～50歲年齡組發(fā)病率為高，結(jié)腸癌患者體內(nèi)硒元素含量常明顯降低［1］，補(bǔ)充硒可以有效降低大鼠及小鼠的皮膚癌、乳腺癌、肝癌及結(jié)腸癌的發(fā)生率［2］，但其機(jī)制尚不完全清楚。Cyclin D1是一種細(xì)胞周期蛋白，與細(xì)胞增殖分化關(guān)系密切，可促進(jìn)細(xì)胞生長分裂Cyclin D1蛋白表達(dá)上調(diào)是癌細(xì)胞永生化的重要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中Cyclin D1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)［3］，且直結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480中Cyclin D1也有表示上調(diào)表現(xiàn)［4］。本研究顯示，HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞中Cyclin D1蛋白大量表達(dá)，給予亞硒酸鈉可明顯抑制HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞Cylin D1表達(dá)，并抑制HT-29細(xì)胞活力。研究結(jié)果提示Cylin D1表達(dá)上調(diào)是HT-29細(xì)胞增殖分化的重要機(jī)制之一，下調(diào)Cylin D1表達(dá)可能是亞硒酸鈉降低HT-29細(xì)胞活力的重要機(jī)制之一。

長春新堿是一種從長春花中提取的生物堿，抗腫瘤作用已獲得廣泛認(rèn)可，但其毒副作用較強(qiáng)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒副作用尤為明顯，且長期使用易產(chǎn)生耐藥性，因而限制了其臨床應(yīng)用。本研究表明，長春新堿可明顯抑制HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞活力，下調(diào)Cyclin D1蛋白表達(dá)。結(jié)果提示長春新堿可通過下調(diào)Cyclin D1抑制HT-29細(xì)胞活力。長春新堿與亞硒酸鈉聯(lián)合給藥對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)抑制作用更為明顯，對(duì)細(xì)胞活力抑制也更為顯著，提示二者聯(lián)合給藥可提高抗腫瘤作用，為結(jié)腸癌的臨床治療提供了理論依據(jù)。

［1］郁寶銘，王敏，許叔祥，等.大腸癌患者硒與免疫功能關(guān)系的研究.上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，34(1):50-53.

［2］杜明，王聰，張?zhí)m威，等.硒的生物學(xué)功能及其補(bǔ)充劑的研究現(xiàn)狀.生物信息學(xué)，2007，5(4):176-178.

［3］金錦蓮，張端蓮，談新提.應(yīng)用組織芯片檢測(cè)大腸癌組織中p27和cyclin D1的表達(dá)及意義.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2012，21(2):113-117.

［4］羅慧，楊洋，許彩民.亞硒酸鈉對(duì)結(jié)直腸癌HCT116和SW480細(xì)胞中β-catenin及下游靶基因cyclin D1表達(dá)的影響.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，33(6):654-658.