氯化甲基汞對K562和C6細胞存活率影響的比較研究

吳曉剛 張琨 李志超 孟令儀 宋昕恬

汞是重要的工業生產原料和產品，在工業中有廣泛用途，作為重金屬物質，其生物學危害也一直被廣泛關注和研究。氯化甲基汞是汞化合物中被研究較多的物質，現已證明其能夠誘導自由基的產生，改變細胞內Ca2+環境，影響蛋白質的磷酸化，干擾線粒體功能以及DNA的復制［1］。近年來有學者提出用MMC為藥物治療白血病的新方法并取得進展［2］，半胱氨酸與氯化甲基汞共軛結合有可能對抑制并殺傷腫瘤細胞有促進作用。為進一步研究氯化甲基汞及其共軛物對腫瘤細胞的影響，本次試驗選取K562和C6細胞作為研究對象，比較MMC及MMC-Cys對兩種細胞存活率的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 RPMll640、DMEM(Gibco)，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，MMC(Merck)，PBS、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，MTT、胰蛋白酶(Sigma)，K562及C6細胞株(ATCC)。CO2培養箱(Hepa)，倒置顯微鏡(奧林帕斯)，酶標儀(Tecan)。

1.2 細胞培養 K562細胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，37℃、5%CO2下培養箱內培養，每2 d換液傳代1次，取對數生長期細胞用于試驗;C6細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃、5%CO2下培養箱內培養，每2～3 d胰酶消化傳代1次，取對數生長期細胞用于試驗。

1.3 MTT法檢測 選擇MTT比色法檢測兩種細胞在不同藥物濃度下的細胞存活率，調節K562和C6細胞密度為5×105個/mL，分別加入不同濃度的MMC和MMC-CYS，終濃度分別為2.5、5.0、10.0 μm/L，接觸時間分別為12 h、24 h，對照組不做處理。酶標儀檢測，波長分別為K562細胞490nm和C6細胞570nm，取平均值計算兩種細胞存活率。

1.4 統計學方法 試驗數據以SPSS 11.5統計軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 K562細胞存活率的檢測結果 K562細胞藥物處理后12 h、24 h后，不同劑量組細胞存活率均顯著下降，MMC和MMC-CYS兩種處理因素對細胞存活率的影響差異無顯著性(P＞0.05)(見表1)。

2.2 C6細胞存活率的檢測結果 C6細胞藥物處理后12 h、24 h后，不同劑量組細胞存活率下降更為明顯，MMC和MMC-CYS兩種處理因素對細胞存活率的影響差異無顯著性(P＞0.05)(見表1)。

表1 MMC和MMC-CYS對K562和C6細胞存活率的影響(12 h)［±s(例，%)］

表1 MMC和MMC-CYS對K562和C6細胞存活率的影響(12 h)［±s(例，%)］

K562 C6劑量(μm/L)12 h 24 h 12 h 24 h MMC MMC-CYS MMC MMC-CYS MMC MMC-CYS MMC MMC-CYS±6.8 70.8±5.2 63.5±6.1 65.3±5.8 5.0 76.3±6.9 77.1±7.3 68.5±6.7 65.2±7.1 63.5±5.7 61.3±6.7 51.7±6.3 49.8±5.7 10.0 65.4±7.5 63.2±5.5 54.1±6.4 58.7±5.2 46.2.5 88.6±7.8 86.7±6.3 80.3±7.9 77.5±6.4 72.6 8±6.2 52.7±5.4 42.1±5.4 44.5±5.5

3 討論

在過去關于氯化甲基汞(MMC)的毒性研究中，已經證明其損傷細胞的作用主要是因為良好的脂溶性，具有多靶點細胞毒效應及放射效應，能抑制線粒體呼吸鏈復合物［3］，改變線粒體膜電位，引起細胞凋亡［4，5］。在本次試驗中，K562和C6細胞在加入MMC 12 h后，細胞存活率顯著下降，并且在較高劑量10.0 μm/L下降更為明顯，在加入受試物24 h后，細胞存活率下降更為明顯。在加入受試物MMC-CYS的試驗組中，隨著時間的延長，兩種細胞的存活率下降趨勢同樣顯著，并且與MMC組的存活率差異不明顯。在兩種細胞K562和C6的比較中，我們發現C6細胞更容易受到MMC的抑制作用，其細胞存活率下降更為顯著。

［1］ Ou YC，Thompson，Kirchener SC，et al.Induction of growh arrest and DNA damage-inducible genes Gadd45 and Gadd153 in primary rodent embryonic cells following exposure to methylmercury．Toxicol Appl Pharmacol，1997，147(1):31．

［2］ 劉秀華，費秉元，等.氯化甲基汞-L-半胱氨酸共軛物誘導惡性腦膠質瘤凋亡的體外研究．中國實驗診斷學，2012，16(4):579-581．

［3］ Hunter AM，Brown DL.Effects of microtubule-associated protein(MAP)expression on methylmercury-induced microtubule disassembly．Toxicol Appl Pharmacol，2000，166(3):203．

［4］ Munro IC，Nera EA，Charbonneau SM et al.Chronic toxicity of Methylmercury in rat．Environ Pathol Toxical，1980，(5-6):437．

［5］ Powis G，Kirkpatrick DL.Thioredoxin Signaling as a target for cancer therapy．Curr Opin Pharmacol，2007，7(4):392．