眼針療法對(duì)D-IBS模型大鼠結(jié)腸VIPR1表達(dá)的影響

王德山 王艷杰 劉慧慧 劉旭東 柴繼嚴(yán) 趙金茹 (遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 0032)

由我國著名針灸學(xué)家彭靜山教授創(chuàng)立的眼針療法，在防治腸易激綜合征等胃腸道功能性疾病方面療效顯著，但是其作用機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察了眼針對(duì)腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)大鼠模型血清、結(jié)腸組織VIP含量及VIP-R1的表達(dá)影響，為眼針防治D-IBS作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠30只，體重(220±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證編號(hào):SCXK(京)2007-0001。分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)7 d以后按隨機(jī)數(shù)字法分為:對(duì)照組、模型組和眼針組，每組10只。

1.2 IBS模型建立與評(píng)價(jià)指標(biāo) 在 Katz和 Williams等〔1，2〕方法基礎(chǔ)上，采用慢性應(yīng)激刺激與束縛結(jié)合方法建立D-IBS模型〔3〕。IBS成模評(píng)價(jià)指標(biāo):①依據(jù)一般狀態(tài)、排便粒數(shù)與結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能;②大鼠的腹部回縮反射(CRD)半定量評(píng)分;③結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.3 眼針刺激方法 通過D-IBS評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)確定模型復(fù)制成功后，眼針組給予眼針刺激，取穴參照人體取穴定位法分別取:下焦區(qū)、大腸區(qū)、肝區(qū)、脾區(qū)〔3〕;刺法:用31號(hào)13 mm毫針，于大鼠眶周2 mm處針刺;手法:平刺，進(jìn)針3 mm，留針20 min。每12 h刺激1次，連續(xù)針刺7 d。模型組只進(jìn)行束縛處理，對(duì)照組不給予刺激。

1.4 結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能測定 造模的第18天和眼針治療后，大鼠禁食24 h，以30%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉，用膠帶束縛大鼠前肢，取直徑為3 mm的玻璃小球放入距肛門3 cm的直腸內(nèi)。大鼠蘇醒后迅速移至籠內(nèi)喂食飲水，籠內(nèi)鋪墊清潔濾紙。觀察1 h內(nèi)大鼠排便的糞點(diǎn)數(shù)和玻璃小球排出時(shí)間。

1.5 內(nèi)臟敏感性評(píng)估 采用腹部回縮反射(AWR)測定法。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，乙醚麻醉狀態(tài)下將帶有球囊的導(dǎo)尿管置入距肛門內(nèi)1 cm處并固定于尾部，將大鼠限制在特制的透明塑料籠(20 cm×6 cm×8 cm)內(nèi)，只能前后運(yùn)動(dòng)而不能轉(zhuǎn)身。清醒30 min后向球囊內(nèi)分別注入容量為1.0、1.5、2.0 ml溫水?dāng)U張結(jié)、直腸 (CRD)，每一容量擴(kuò)張持續(xù)時(shí)間為20 s，間隔30 s;重復(fù)3次。根據(jù)腹部回縮反射評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行AWR評(píng)分，取3次評(píng)分的平均值。分值越高為內(nèi)臟敏感性越強(qiáng)。

大鼠AWR評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔4〕:0分:大鼠對(duì)結(jié)腸擴(kuò)張時(shí)無行為反應(yīng);1分:結(jié)腸擴(kuò)張時(shí)身體靜止不動(dòng)，頭部運(yùn)動(dòng)減少;2分:結(jié)腸擴(kuò)張時(shí)腹肌收縮但未抬離桌面;3分:結(jié)腸擴(kuò)張時(shí)腹肌收縮并抬離桌面;4分:結(jié)腸擴(kuò)張時(shí)骨盆抬起，身體呈弓狀。

1.6 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 手術(shù)取距肛門上10 cm處取結(jié)腸全層組織，常規(guī)用HE染色，光鏡觀察組織病理學(xué)變化。

1.7 血清和結(jié)腸組織中VIP含量的測定 眼針結(jié)束后，麻醉后腹主動(dòng)脈取血3 ml，分離血清供檢測用;取盲腸上結(jié)腸組織，清理干凈后按1∶9加入預(yù)冷生理鹽水制備勻漿，離心取上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行ELISA檢測。利用全自動(dòng)酶標(biāo)儀，在450 nm處測定各孔的OD值，采用Curve Expert 1.3進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，并計(jì)算出對(duì)應(yīng)的濃度值。

1.8 結(jié)腸組織中VIP-R1的mRNA與蛋白表達(dá)檢測 Trizol及RT-PCR試劑盒、引物由大連寶生物工程提供。VIP-R1基因表達(dá)采用二步法進(jìn)行RT和PCR操作，利用Trizol試劑進(jìn)行總RNA的提取，以紫外分光光度計(jì)測量吸光度，記錄OD260及OD280值，二者比值即為總RNA純度。取OD260/OD280在1.8～2.0之間的RNA按照RT試劑盒要求逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取5 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板在25 μl體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 2 min;94℃30 s，65℃30 s，72℃30 s，共 30 個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后，利用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描和分析擴(kuò)增帶，與內(nèi)參β-actin比較，得到VIP-R1 mRNA的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。參照SABC試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化法檢測結(jié)腸組織中VIP-R1蛋白表達(dá)。應(yīng)用BI-2000圖像分析系統(tǒng)，隨機(jī)選取每張切片的3～5個(gè)視野，×200光鏡下測定陽性細(xì)胞的平均光密度值，平均光密度值代表陽性表達(dá)參數(shù)，平均光密度值越大，陽性表達(dá)越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠一般狀態(tài)的影響 在本實(shí)驗(yàn)過程中無動(dòng)物死亡。與對(duì)照組比較，模型制備過程中大鼠毛色漸晦暗、進(jìn)食和活動(dòng)減少，體形消瘦;表現(xiàn)極度煩躁，出現(xiàn)躲避、畏懼、嘶叫、互相對(duì)峙、甚至扭打撕咬等易激惹表現(xiàn);排便次數(shù)明顯增多，便質(zhì)變軟變稀，糞點(diǎn)不成型;排出玻璃小球時(shí)間明顯縮短;大鼠AWR評(píng)分均明顯增高;顯微鏡下大鼠結(jié)腸組織各層無白細(xì)胞浸潤，間質(zhì)有水腫。根據(jù)成模標(biāo)準(zhǔn)D-IBS大鼠模型復(fù)制成功。經(jīng)過眼針治療后，與模型組比較，眼針組大鼠表現(xiàn)為活潑好動(dòng)，毛發(fā)光澤，體重增加，激惹及輕度好斗傾向緩解。小球排出時(shí)間延長，排便次數(shù)和大便粒數(shù)明顯減少而成型、便質(zhì)逐漸恢復(fù)正常(圖1)。

AWR用于檢測大鼠內(nèi)臟敏感性實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠在1.0、1.5、2.0容量擴(kuò)張下AWR評(píng)分均顯著升高(P＜0.05);與模型組比較，眼針組AWR評(píng)分則明顯降低(P＜0.05)，表明眼針能夠降低D-IBS模型大鼠內(nèi)臟敏感性。

2.2 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠血清及結(jié)腸組織中VIP含量的影響 如表1所示，各組血清中VIP含量變化均高于結(jié)腸組織值。與對(duì)照組比較，模型組和眼針組大鼠血清VIP水平均升高(P＜0.01)，尤以模型組升高顯著(P＜0.01);眼針組的結(jié)腸組織中VIP含量明顯低于模型組(P＜0.05)，與對(duì)照組沒有顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠排便顆粒數(shù)的影響

圖2 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠AWR評(píng)分的影響

表1 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠血清及結(jié)腸組織VIP含量的影響(n=10，±s，ng/L)

表1 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠血清及結(jié)腸組織VIP含量的影響(n=10，±s，ng/L)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 血清 結(jié)腸組織對(duì)照組3.09±1.65 2.812±0.112模型組 10.46±3.331) 4.258±0.3111)眼針組 5.63±2.331)2) 2.902±0.2351)2)

2.3 眼針對(duì)D-IBS大鼠模型結(jié)腸組織中VIP-R1表達(dá)的影響

應(yīng)用免疫組化方法檢測觀察到，上皮組織由吸收細(xì)胞和杯狀細(xì)胞組成，VIP-R1蛋白陽性物表達(dá)部位主要在結(jié)腸黏膜上皮組織中，呈棕黃色反應(yīng)(圖3)。與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織VIP-R1陽性反應(yīng)呈現(xiàn)出密集的表達(dá)，與模型組(0.351±0.024)比較，眼針組 VIP1-R陽性表達(dá)(0.265±0.010)均顯著降低(P＜0.05)，與對(duì)照組(0.232±0.012)比較差異顯著(P＜0.01)。結(jié)腸組織中VIP-R1 mRNA表達(dá)檢測結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組(0.742±0.130)比較，模型組VIP-R1 mRNA的表達(dá)(1.522±0.278)明顯上調(diào)(P＜0.05)，其變化趨勢與VIP含量改變一致。經(jīng)過眼針刺激，眼針組VIP-R1 mRNA的表達(dá)量(0.440±0.201)與模型組比較則明顯下調(diào)(P＜0.05)。提示眼針對(duì)D-IBS模型大鼠結(jié)腸中VIP-R1 mRNA高表達(dá)具有抑制作用。

圖3 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠結(jié)腸組織中VIP-R1蛋白表達(dá)影響(DAB，×400)

圖4 眼針對(duì)D-IBS模型大鼠結(jié)腸組織中VIP-R1 mRNA表達(dá)結(jié)果影響

3 討論

IBS是以腹痛或腹部不適，伴有大便形狀和排便習(xí)慣改變?yōu)樘卣鞯墓δ芪蓙y性腸道疾病，臨床檢查多無明顯器質(zhì)性和異常的生化指標(biāo)變化。目前臨床多傾向于以羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型，該分型主要以糞便中含水量為重要依據(jù)，其中尤以腹瀉型占據(jù)比例最大〔5，6〕。關(guān)于D-IBS發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。研究發(fā)現(xiàn)D-IBS患者結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞水通道蛋白(AQPs)表達(dá)發(fā)生明顯改變〔7～9〕，提示與結(jié)腸組織水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)功能異常而導(dǎo)致了內(nèi)臟高敏感性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠除了一般狀態(tài)出現(xiàn)各種類似人類的焦躁、抑郁等精神神經(jīng)性改變外，其腹瀉、大便中含水量均多于正常組，同時(shí)伴有AWR分值升高，支持了D-IBS狀態(tài)下結(jié)腸水分子轉(zhuǎn)運(yùn)功能異常與內(nèi)臟高敏感性存在的觀點(diǎn)。

AQPs是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞膜內(nèi)外轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的關(guān)鍵性蛋白，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)分布在消化道，特別是結(jié)腸組織的AQPs類型與數(shù)量多而廣泛，其中以AQP3和AQP8與結(jié)腸水分子轉(zhuǎn)運(yùn)功能關(guān)系最為密切。實(shí)驗(yàn)證實(shí)D-IBS患者大便含水量增多，排便頻率增加，是由于結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞AQPs的表達(dá)下調(diào)所致〔7，8〕。對(duì)于AQPs表達(dá)的調(diào)控研究表明，VIP是調(diào)控人結(jié)腸上皮細(xì)胞AQP8表達(dá)的主要腦-腸肽物質(zhì)之一〔10〕，并發(fā)現(xiàn)D-IBS患者以及脾虛腹瀉動(dòng)物等血和結(jié)腸組織中VIP水平均升高〔11～13〕，從而支持了D-IBS狀態(tài)下的腹瀉發(fā)生機(jī)制可能與VIP分泌增加影響了AQPs表達(dá)的推測。

VIP受體是介導(dǎo)VIP信息傳遞的靶標(biāo)蛋白分子，VIP信息傳遞所引起的生物效應(yīng)不但取決于血清及組織中含量，而且與VIP受體在靶細(xì)胞表達(dá)量有著直接關(guān)系。VIP受體(VIP-R)已經(jīng)被克隆出3個(gè)亞型，屬于G蛋白耦聯(lián)型受體〔14〕，分布在消化道的VIP受體分為VIP-R1和VIP-R2兩種亞型，其中VIP-R1表達(dá)部位主要在結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞上，VIP-R1與VIP具有高親和力。VIP與VIP-R1結(jié)合后激活G蛋白耦聯(lián)受體，可能通過cAMP-PKA跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響了AQPs的表達(dá)〔15〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清、結(jié)腸組織中不但VIP含量顯著增加，而且結(jié)腸組織細(xì)胞上VIP-R1表達(dá)也明顯上調(diào)。由此認(rèn)為，D-IBS狀態(tài)下由于體內(nèi)VIP過量分泌與釋放的同時(shí)，結(jié)腸組織細(xì)胞上的VIP-R1高表達(dá)是加劇了VIP的病理生理效應(yīng)又一重要原因。由于VIP含量增高及VIP-R1的高表達(dá)則影響了AQPs表達(dá)，進(jìn)而降低了結(jié)腸內(nèi)水液的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，導(dǎo)致了內(nèi)臟敏感性增加。

眼針療法是彭靜山教授依據(jù)中醫(yī)學(xué)經(jīng)典臟腑、經(jīng)絡(luò)等理論，運(yùn)用五輪、八廓以及八卦學(xué)說，并結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)所創(chuàng)立的一種微針療法〔16〕。是將眼睛周圍按照八卦分為八區(qū)十三穴，而對(duì)應(yīng)人體相應(yīng)的五臟六腑、器官組織等。通過辨證選取相應(yīng)的穴位進(jìn)行針刺而達(dá)到治療全身不同部位疾病的目的。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用眼針方法選取相應(yīng)穴位進(jìn)行刺激后，在D-IBS大鼠一般狀態(tài)得到恢復(fù)，以及腹瀉癥狀得到控制的同時(shí)，其血清和結(jié)腸組織VIP水平出現(xiàn)明顯下降，結(jié)腸組織細(xì)胞上VIP-R1的蛋白與基因表達(dá)也出現(xiàn)明顯的下調(diào)。提示了眼針治療D-IBS腹瀉和內(nèi)臟高敏感性的機(jī)制之一，可能與抑制血中、結(jié)腸組織中VIP過量分泌與釋放，同時(shí)下調(diào)結(jié)腸相關(guān)細(xì)胞上VIP-R1的表達(dá)有關(guān)。由于VIP含量下降和受體表達(dá)下調(diào)則減輕或解除了對(duì)AQPS影響，使結(jié)腸內(nèi)水液轉(zhuǎn)運(yùn)功能得以恢復(fù)，并降低內(nèi)臟敏感性的異常，而達(dá)到了治療D-IBS的效果。

在本實(shí)驗(yàn)中，眼針對(duì)于血清，特別是對(duì)結(jié)腸組織中VIP含量、VIP-R1受體表達(dá)的影響途徑，VIP對(duì)結(jié)腸組織細(xì)胞上何種類型AQPS表達(dá)進(jìn)行影響，以及是否還通過其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)AQPS進(jìn)行影響等，均有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。無疑，闡明這些問題將對(duì)眼針治療D-IBS的機(jī)制將會(huì)提供更多依據(jù)。

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