胃腸道間質(zhì)瘤中干細(xì)胞因子的表達(dá)及與其細(xì)胞增殖的關(guān)系

侯曉瑋，白辰光，馬大烈，莊興俊

胃腸道間質(zhì)瘤 （gastrointestinal stromal tumor，GIST）為最常見的胃腸道間葉來源腫瘤，其常見的發(fā)病部位為胃、小腸、結(jié)直腸等。GIST起源于消化道間質(zhì)的 Cajal細(xì)胞（interstitial cell of Cajal，ICC）或其更原始的祖細(xì)胞[1]，腫瘤中存在c-Kit基因（75%～80%）或PDGFRA基因（5%～10%）的功能獲得性突變[2-5]，這些突變導(dǎo)致非配體依賴的受體蛋白的持續(xù)活化，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，阻止細(xì)胞發(fā)生凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，這被認(rèn)為是GIST的經(jīng)典發(fā)病機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，部分GIST具有惡性行為，能夠發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。目前認(rèn)為所有的GIST都有惡性潛能。Flether等提出腫瘤大小和有絲分裂指數(shù)可以作為GIST危險(xiǎn)度評(píng)估的指標(biāo)[6]，Ki-67指數(shù)也可作為GIST預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。但是目前促使GIST細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的原因卻尚未清楚。干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）為 KIT受體蛋白的配體，由 Steel基因編碼，由于不同的mRNA剪接方式，表達(dá)為分子量為31 kD的膜結(jié)合型蛋白 （mSCF）和分子量為18.5 kD的可溶性蛋白（sSCF）兩種形式[7]。在正常情況下，SCF與KIT受體結(jié)合，誘導(dǎo)KIT蛋白胞外區(qū)的構(gòu)象發(fā)生變化，使受體在細(xì)胞膜上遷移、聚集，形成二聚體，使胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化，調(diào)控MAPK和PI3-K等多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終活化胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化。研究發(fā)現(xiàn)，由可溶性SCF激活的KIT蛋白通過泛素-蛋白酶體通路迅速被降解，而由膜結(jié)合型SCF蛋白激活的KIT能夠保持穩(wěn)定和持久的活性[8]。目前已證實(shí)SCF/KIT通路的活化在ICCs和造血干細(xì)胞的增殖分化過程中發(fā)揮重要作用[9]，而近期研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤如宮頸腺鱗癌、惡性黑素瘤、Merkel細(xì)胞癌、白血病、轉(zhuǎn)移性前列腺癌和胰腺癌中，SCF/KIT系統(tǒng)的激活參與了腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移[10-16]。在GIST中，SCF是否也通過自分泌或旁分泌方式存在，SCF是否能夠發(fā)揮活化GIST細(xì)胞中KIT蛋白的功能，SCF/KIT信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的激活是否在GIST細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用，值得研究探討。

在本研究中，筆者檢測(cè)了68例GIST組織中SCF的表達(dá)，分析SCF表達(dá)情況與GIST預(yù)后評(píng)估表 指標(biāo)的關(guān)系，同時(shí)結(jié)合c-Kit基因的突變狀態(tài)分析，探索c-Kit基因的突變與SCF表達(dá)有無相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 病例資料 收集筆者所在醫(yī)院2002～2009年經(jīng)病理診斷確診的GIST患者共68例。男29例，女39例；年齡23～84歲，平均55歲。腫瘤發(fā)生于胃43例（63.2%）、小腸 21例（30.1%）、直腸 2例（2.9%）、未知部位2例（2.9%）。腫瘤直徑0.8～22.0 cm，平均5.8 cm。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 在石蠟組織標(biāo)本的HE染色切片中光鏡下對(duì)病變組織進(jìn)行定位，用蠟塊組織取樣器，每例取直徑4 mm的病變組織，重復(fù)3次，制作石蠟組織芯片。使用的抗體分別為兔抗人SCF單克隆抗體 （1∶250）、兔抗人KIT多克隆抗體（1∶150）、兔抗人 Ki-67 單克隆抗體（1∶100）。 免疫組化步驟按Envision法，抗原修復(fù)方法均為檸檬酸熱修復(fù)。免疫組化結(jié)果判定方法為：SCF和KIT陽性為胞膜或胞漿呈明顯棕黃色顯色；Ki-67陽性強(qiáng)度判定是在顯微鏡400倍視野下，計(jì)算5個(gè)視野的細(xì)胞總數(shù)，以腫瘤細(xì)胞核明顯呈棕黃色者為陽性，陽性細(xì)胞數(shù)除以腫瘤細(xì)胞總數(shù)，即為Ki-67抗原標(biāo)記的細(xì)胞增殖指數(shù)：設(shè)定<5%為-，5%～10%為+，>10%為++。

1.3 組織蛋白抽提與Western-blot檢測(cè) 切取黃豆大小新鮮組織，將組織勻漿，加入RIPA裂解液400 μl，冰上裂解 30 min，經(jīng) 12 000 r/min 低溫離心15 min后吸取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg/孔，常規(guī)SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，含有0.05%Tween20、5%脫脂奶粉的封閉液封閉PVDF膜2 h，一抗兔抗人SCF單克隆抗體（1∶5000）、兔抗人 KIT 多克隆抗體（1∶1000）、內(nèi)參蛋白 GAPDH(1∶10 000，上海康成生物)各 3 ml，4℃孵育過夜，洗膜，按1∶10 000加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗37℃孵育2 h，洗膜后加入ECL系統(tǒng)，暗室顯影2～3 min后沖洗膠片。

1.4 c-Kit基因突變檢測(cè) 采用蛋白酶K消化/苯酚-氯仿法抽提組織基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增c-Kit基因，體系為2 μl模板DNA、25 μl 2×Taq PCR MasterMix（北京天為時(shí)代科技有限公司），上下游引物 (10 μmol/l) 各 1 μl，終體積50 μl（引物序列見表 1），反應(yīng)條件為 94 ℃ 1 min、60℃ 1 min、72℃ 1 min至38個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送上海生工生物公司測(cè)序。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)和McNemar檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A、C：SCF 在 GIST 中的表達(dá)；B、D：KIT 在 GIST 中的表達(dá)（×400）圖 1 免疫組化檢測(cè)SCF和KIT在GIST中的表達(dá)

圖2 Western-blot檢測(cè)GIST中SCF和KIT的表達(dá)

2 結(jié)果

2.1 GIST細(xì)胞中SCF及相關(guān)蛋白的表達(dá) 免疫組化檢測(cè)68例GIST組織，其中52例組織中SCF表達(dá)陽性，表達(dá)率為76%，在幾乎所有的陽性標(biāo)本中，SCF表達(dá)均位于腫瘤細(xì)胞的胞膜和/或胞漿；KIT蛋白在所檢標(biāo)本中均表達(dá)。部分腫瘤細(xì)胞的胞核可見Ki-67 表達(dá)（圖 1）。

2.2 Western-blot檢測(cè)SCF蛋白 為進(jìn)一步明確SCF蛋白在GIST中的表達(dá)形式，在其中的21例新鮮GIST組織中行蛋白印跡檢測(cè)SCF的表達(dá)。結(jié)果，其中17例標(biāo)本SCF表達(dá)陽性，在分子量為31 kD處可見明顯陽性條帶，其表達(dá)與免疫組化檢測(cè)結(jié)果相一致；同時(shí)在所有檢測(cè)標(biāo)本中，分子量為145 kD處均可檢測(cè)到KIT蛋白的陽性條帶（圖2）。

2.3 SCF表達(dá)與腫瘤增殖相關(guān)因素的關(guān)系 根據(jù)Fletcher提出的GIST危險(xiǎn)度分級(jí)[6]，所檢測(cè)的標(biāo)本分為極低危2例、低危21例、中危23例及高危22例。在極低危2例中無SCF表達(dá)，而SCF在低危、中危和高危標(biāo)本中的陽性表達(dá)率分別為71%、78%和86%（表2）；52例SCF表達(dá)陽性標(biāo)本中，腫瘤平均最大徑為6.1 cm，高于不表達(dá)SCF的標(biāo)本組的平均最大徑4.9 cm。經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)，SCF陽性標(biāo)本中的每50個(gè)高倍視野病理性核分裂數(shù)較SCF陰性標(biāo)本明顯增多（表3）；表達(dá)SCF標(biāo)本組的Ki-67增殖指數(shù)也明顯高于SCF陰性標(biāo)本（表4）。

2.4 c-Kit基因突變分析及其與SCF表達(dá)的關(guān)系將68例GIST組織的c-Kit基因行PCR擴(kuò)增后，成功測(cè)序54例，有37例c-Kit基因發(fā)生突變，其中外顯子11突變31例，外顯子9突變6例；其余17例組織未發(fā)現(xiàn)c-Kit基因突變。結(jié)合SCF表達(dá)情況，經(jīng)McNemar檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，c-Kit基因的突變與否與SCF表達(dá)無明顯相關(guān)性（表5）。

表 2 SCF在不同危險(xiǎn)度分級(jí)GIST中的表達(dá)

表 3 不同SCF表達(dá)的GIST病理性核分裂數(shù)

表 4 不同SCF表達(dá)的GIST中Ki-67增殖指數(shù)

表 5 GIST中SCF表達(dá)與c-kit突變的相關(guān)性

3 討論

胃腸道間質(zhì)瘤為最常見的消化道間葉來源腫瘤，KIT蛋白的表達(dá)為GIST最重要的病理特征，c-Kit基因發(fā)生功能獲得性突變導(dǎo)致KIT蛋白自動(dòng)磷酸化而激活下游信號(hào)傳導(dǎo)，是GIST的重要發(fā)病機(jī)制，但是GIST細(xì)胞繼續(xù)增殖和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全闡明。GIST中因發(fā)生自主磷酸化而活化的KIT蛋白為純和型突變基因所編碼蛋白，然而約20%的GIST無c-Kit突變，且c-Kit突變的GIST中94%的病例為雜和型突變[17]，而幾乎所有GIST中的KIT蛋白均可發(fā)生磷酸化[18]，這提示GIST中是否存在另外某種機(jī)制促使未突變的c-Kit基因編碼的蛋白發(fā)生活化？

KIT蛋白不僅僅在GIST中表達(dá)，已有研究發(fā)現(xiàn)，在粒細(xì)胞白血病、精原細(xì)胞瘤、惡性黑素瘤、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌和卵巢癌中均有KIT蛋白表達(dá)[19-25]，在這些腫瘤中，KIT蛋白和其配體SCF的共表達(dá)提示KIT/SCF信號(hào)通路在腫瘤的增殖過程中發(fā)揮作用。最新研究也證實(shí)，KIT蛋白的配體SCF通過自/旁分泌促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞、惡性黑素瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞增殖，在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的組織中也發(fā)現(xiàn)KIT和SCF高表達(dá)[10-16]。因此，在KIT表達(dá)率高達(dá)95%的GIST中，SCF是否存在并發(fā)揮作用，野生型c-Kit基因所編碼的KIT蛋白是否是被其配體SCF激活，這種激活作用是否是GIST細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一，均有待于研究和解釋。

在本研究中通過免疫組織化學(xué)和Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在GIST中存在著SCF的高表達(dá)，其表達(dá)率為76%，并且KIT和SCF的共表達(dá)率也達(dá)到74%。此結(jié)果證實(shí)SCF蛋白在GIST中確切存在。Bono等在GIST患者的血清中檢測(cè)到SCF[26]，也支持本文結(jié)果。可以推論在GIST中存在SCF的自分泌。同樣也有研究在正常胃腸道組織中檢測(cè)到SCF的分泌[27]，結(jié)合前述結(jié)果可以進(jìn)一步肯定GIST中存在SCF的自/旁分泌。經(jīng)過蛋白印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GIST中所表達(dá)的SCF蛋白為分子量31 kD的膜結(jié)合型蛋白，此型蛋白對(duì)KIT的激活作用能夠達(dá)到穩(wěn)定和持久，可以證明GIST中存在的SCF具備激活KIT活性的生物學(xué)功能。

目前研究認(rèn)為，所有的GIST都具有惡性潛能[6]，腫瘤大小、有絲分裂指數(shù)和Ki-67都作為評(píng)價(jià)腫瘤惡性行為的指標(biāo)而被廣泛采用。本研究發(fā)現(xiàn)，相比較于不表達(dá)SCF的GIST，SCF陽性的腫瘤具有更大的體積，有絲分裂指數(shù)也明顯增高；在表達(dá)SCF及SCF/KIT共表達(dá)的GIST中，腫瘤細(xì)胞胞核Ki-67染色強(qiáng)度明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；同樣，F(xiàn)letcher危險(xiǎn)度分級(jí)較高的患者，也具有高的SCF表達(dá)率。以上結(jié)果均可以初步證實(shí)，SCF的表達(dá)與GIST的潛在惡變存在一定關(guān)系，SCF活化KIT蛋白可能是促進(jìn)GIST細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的主要因素之一。結(jié)合c-Kit基因突變狀態(tài)分析，筆者發(fā)現(xiàn)，SCF表達(dá)與否與c-Kit突變并無明顯相關(guān)性，提示在GIST中，無論是否存在突變導(dǎo)致的不依賴配體的KIT蛋白自主磷酸化，SCF都有廣泛表達(dá)，而SCF的表達(dá)就意味著配體依賴的信號(hào)通路即SCF/KIT信號(hào)傳導(dǎo)通路可能被激活，這也從另一方面證明了SCF在不同突變類型的GIST中促進(jìn)腫瘤增殖和惡性轉(zhuǎn)化的可能性。

綜上所述可見，SCF能夠通過自/旁分泌途徑在GIST中發(fā)揮刺激細(xì)胞增殖的作用；GIST中可能存在KIT蛋白自動(dòng)磷酸化之外的另外一條重要細(xì)胞增殖信號(hào)通路，即依賴配體SCF的KIT活化，c-Kit突變可能是腫瘤發(fā)生的早期事件，而SCF/KIT通路是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的重要因素。但是，SCF在不同突變類型的GIST中發(fā)揮作用有何不同，在對(duì)野生型KIT蛋白的激活作用之外，對(duì)突變型KIT蛋白的活化有何影響，這些問題仍需進(jìn)一步深入研究和探討，研究GIST中SCF/KIT信號(hào)通路的功能作用，有望闡明GIST增殖和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的思路和證據(jù)。

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