MAGE基因在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

黎 濤，白崇峰，馬春山，于晉建，王 云

MAGE（melanoma antigen）基因是首先由 Boon等[1]從惡性黑素瘤中分離、鑒定出的一族腫瘤特異性抗原基因，其中MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3基因是最早被發(fā)現(xiàn)的三個(gè)成員。MAGE-1基因第3外顯子編碼的一段多肽抗原經(jīng)MHC-Ⅰ類分子HLAA1呈遞后，能夠被自體殺傷性T淋巴細(xì)胞（CTL）識(shí)別，誘導(dǎo)CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （RT-PCR）和DNA印跡（Southern blot）的方法，對(duì)MAGE基因家族的3個(gè)成員 MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA 在 56 例非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中的表達(dá)情況進(jìn)行觀察，探討以該基因家族成員作為靶點(diǎn)對(duì)NSCLC患者進(jìn)行免疫治療的可能性。

1 資料和方法

1．1 細(xì)胞系與標(biāo)本 以人髓性甲狀腺癌細(xì)胞系TT作為陽性對(duì)照[1]，以小鼠成纖維細(xì)胞系3T3TK作為陰性對(duì)照。TT細(xì)胞和人肺腺癌細(xì)胞系SPC-A-1購自上海中科院細(xì)胞庫，3T3TK、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、A431均由上海長征醫(yī)院全軍臨床免疫中心細(xì)胞免疫室提供，上述細(xì)胞系均貼壁生長于含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中。56例NSCLC和相鄰正常肺組織標(biāo)本取自上海長征醫(yī)院胸外科手術(shù)患者。其中男35例，女21例；年齡33～75歲，平均64.4歲；術(shù)后病理證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌29例，腺癌25例，大細(xì)胞癌2例。病變組織被切除后5~10 min進(jìn)行取材，剪取腫瘤組織和相鄰正常肺組織并立即凍存于液氮中，以保證mRNA不被降解。

1．2 總RNA抽提 培養(yǎng)細(xì)胞 （5~10）×106個(gè)加入1 ml Trizol裂解液（Gibco BRL公司），覆蓋整個(gè)單層細(xì)胞；將標(biāo)本組織剪碎放入勻漿器中，50 mg加入1 ml Trizol，徹底勻漿。將上述培養(yǎng)細(xì)胞和標(biāo)本組織的裂解物移入1.5 ml Eppendorf管中，室溫放置5 min，加入 200 μl氯仿，振蕩混勻，室溫靜置 5 min；1.3×104r/min，4℃離心15 min，將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈的1.5 ml Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置 10 min；1.3×104r/min，4 ℃離心10 min，棄上清，加入 1 ml 75%乙醇溶液，1.3×104r/min，4℃離心10 min，棄上清，將沉淀置于室溫干燥10 min，用DEPC處理水溶解，分光光度計(jì)定量。

1．3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈及PCR反應(yīng) 按AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司）說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，取 2 μg總 RNA，加入 3 μl AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶，配成終體積為25 μl的反應(yīng)體系，將該體系置于42℃孵育60 min，94℃ 5 min滅活酶，貯存于-20℃待擴(kuò)增。MAGE-1基因第3外顯子擴(kuò)增引物序列[1]：上游 5’-AGT CCT CAG GGA GCC TCC-3’，下游：5’-ACT CAG CTC CTC CCA GAT TT-3’。 內(nèi)對(duì)照β-actin的擴(kuò)增引物序列為：上游：5-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3，下游：5-AAG AGA GCC TCG GGG CAT CGG AAC CGC TCA-3。PCR反應(yīng)體系的配制和反應(yīng)條件見參考文獻(xiàn)[1]。每份標(biāo)本均以β-actin為內(nèi)對(duì)照，除引物不同外其余條件相同。PCR反應(yīng)在PE9600型（USA）擴(kuò)增儀中進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分析，數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的轉(zhuǎn)膜及探針雜交 將細(xì)胞系TT、3T3TK、SPC-A-1、A549、A431 和 33 例 MAGE基因表達(dá)陽性的瓊脂糖凝膠回收，通過毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)至尼龍膜上。MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3基因特異性寡核苷酸探針序列分別為[1]：MAGE-1：5’-GGC AAC CCA GTG AGG GTT C-3’；MAGE-2：5’-GAC AAT CCG ATG AGG GCT C-3’；MAGE-3：5’ -GCC AAT CCT ATG AGG ACT C-3’。按地高辛標(biāo)記試劑盒說明將上述寡核苷酸探針進(jìn)行標(biāo)記，在適宜條件下用地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分子雜交[2]，最后加入適量酶底物液顯色并拍照。

1：電泳 Marker；2：TT；3：SPC-A-1；4：3T3TK；5：A549；6：A431 7、9、11：腫瘤標(biāo)本①、②、③；8、10、12：正常肺標(biāo)本①、②、③圖 1 RT-PCR擴(kuò)增編碼MZ2-E抗原的基因片段

1：TT；2：3T3TK；3：SPC-A-1；4：A549；5：A431；6～38：33 例腫瘤標(biāo)本圖 2 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Southern Blot分析結(jié)果

圖 3MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA在NSCLC中的表達(dá)形式

2.1 MAGE基因在NSCLC組織中的表達(dá) RTPCR目的基因長度為489bp，內(nèi)對(duì)照β-actin長度為422 bp。3種人肺癌細(xì)胞系均表達(dá)該產(chǎn)物；56例NSCLC患者腫瘤組織中，33例表達(dá)該產(chǎn)物，表達(dá)率為58.9%，正常肺組織均不表達(dá)該產(chǎn)物。檢測(cè)樣品的內(nèi)對(duì)照β-actin均有表達(dá)（圖1）。

2.2MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA 在NSCLC組織中的表達(dá) 3種人肺癌細(xì)胞系中，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA的表達(dá)情況如下：SPCA-1：MAGE-1+、-2+、-3+，A549：MAGE-1+、-2-、-3+，

2 結(jié)果

A431：MAGE-1+、-2+、-3+。56 例 NSCLC 標(biāo)本中，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA 的表達(dá)例數(shù)分別是 27、18、30，表達(dá)率分別為 48.2%、32.1%、53.6%（圖2）。33例MAGE基因表達(dá)陽性的NSCLC標(biāo)本中，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA 的表達(dá)形式為：MAGE-1+、-2+、-3+：12 例；MAGE-1+、-2-、-3+：12 例；MAGE-1-、-2+、-3+：4 例；MAGE-1+、-2+、-3-：2 例；MAGE-1-、-2-、-3+：2 例；MAGE-1+、-2-、-3-：1例；沒有一例標(biāo)本單獨(dú)表達(dá)MAGE-2 mRNA。見圖3。

3 討論

MAGE基因家族的編碼蛋白是腫瘤特異性抗原的典型代表。人類MAGE基因家族定位于X染色體上[3]，其家族成員之間的同源性達(dá)80%～99%。MAGE基因正常情況下僅在睪丸和胎盤組織中有少量表達(dá)，但在多種不同組織來源的惡性腫瘤組織中，該家族基因成員如 MAGE-1、-2、-3、-4、-6 及-12卻常被激活而有不同程度的表達(dá)，這可能與腫瘤組織中甲基化調(diào)節(jié)過程的失控有關(guān)[4]。近期的研究表明，NSCLC組織中，由MAGE基因啟動(dòng)子去甲基化介導(dǎo)的MAGE基因表達(dá)與NSCLC的侵襲性密切相關(guān)[5]。

本研究采用RT-PCR的技術(shù)，用MAGE-1基因第3外顯子的擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，MAGE-2和MAGE-3基因在這段序列上與MAGE-1基因具有高度同源性，若有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，則表明這三個(gè)基因成員中至少有一種mRNA在檢測(cè)對(duì)象中有表達(dá)，以此了解MAGE基因在NSCLC組織中的表達(dá)率。

本文資料顯示MAGE基因家族三個(gè)成員在NSCLC中的表達(dá)率為58.9%，表明以MAGE基因家族成員作為NSCLC免疫治療的攻擊靶點(diǎn)能夠覆蓋超過半數(shù)的患者，并有較好的特異性。3種人肺癌細(xì)胞系均表達(dá)MAGE基因，這為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)中所檢測(cè)的56例正常肺組織均不表達(dá)MAGE基因，說明該基因在NSCLC組織中具有腫瘤組織特異性，有望成為一類新的腫瘤標(biāo)志物而在NSCLC的早期診斷、微轉(zhuǎn)移灶檢測(cè)和復(fù)發(fā)的檢測(cè)等工作中發(fā)揮作用。

本研究還應(yīng)用Southern blot的方法，對(duì)MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3mRNA 在 NSCLC 組織中各自的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，MAGE-1、MAGE-3mRNA 在3種人肺癌細(xì)胞系中均有表達(dá)，MAGE-2 mRNA在2種人肺癌細(xì)胞系中有表達(dá)，這為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究包括特異性序列的克隆、轉(zhuǎn)染等提供了條件。本文資料顯示，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA的表達(dá)率分別為48.2%、32.1%、53.6%，與歐洲學(xué)者的報(bào)道相比，MAGE-1和MAGE-3較高，MAGE-2相近[6]；而日本學(xué)者的研究證實(shí)，MAGE-1和MAGE-3在NSCLC組織中的表達(dá)率分別為32.7%和41.8%[7]，比本文資料顯示的表達(dá)率低，說明我國NSCLC患者更適宜以MAGE-1和MAGE-3基因作為免疫治療的攻擊靶點(diǎn)。關(guān)于此3種基因的具體表達(dá)形式，本文結(jié)果表明，3種基因同時(shí)表達(dá)以及MAGE-1、MAGE-3基因同時(shí)表達(dá)所占的比例最高，而沒有一例標(biāo)本單獨(dú)表達(dá)MAGE-2基因，這一結(jié)果與Hiroshi等[8]對(duì)食管癌的研究結(jié)果相似。由于對(duì)MAGE基因的確切功能尚存爭議，因此目前還沒有準(zhǔn)確的依據(jù)對(duì)這一結(jié)果作出合理解釋。

MAGE基因的發(fā)現(xiàn)有力地推動(dòng)了人類腫瘤特異性免疫的研究，以該基因家族成員為疫苗對(duì)腫瘤進(jìn)行免疫治療不斷取得新進(jìn)展[9]。抗原的識(shí)別、加工、提呈以及T細(xì)胞的致敏、激活和擴(kuò)增依賴于抗原提呈細(xì)胞 （APC）的參與和作用。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）是功能最強(qiáng)的 APC，DC 能攝取和加工抗原，表達(dá)高水平MHC分子、共刺激分子、粘附分子并分泌高水平Th1型細(xì)胞因子IL-12，故有很強(qiáng)的抗原提呈能力，能有效激發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答，將MAGE基因家族編碼的抗原與DC聯(lián)合應(yīng)用已成為腫瘤免疫治療的新方法[10]。

[1]van der Bruggen P,Traversari C,Chomez P,et al.A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on human melanoma[J].Science,1991,254(5038):1643-1647.

[2]姜 泊.分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，1996.77-82.

[3]de Backer,Verheyden AM,Martin B,et al.Structure,chromosomal location,and expression pattern of three mouse genes homologous to the human MAGE genes[J].Genomics,1995,28(1):74-83.

[4]Serrano A,Garcia A,Abril E,et al.Methylated CpG points identified within MAGE-1 promoter are involved in gene repression[J].Int J Cancer,1996,68(4):464-470.

[5]Yanagawa N,Tamura G,Oizumi H,et al.MAGE expressions mediated by demethylation of MAGE promoters induce progression of non-small cell lung cancer[J].Anticancer Res,2011,31(1):171-175.

[6]Weynants P,Lethe B,Brasseur F,et al.Expression of MAGE genes by non-small cell lung carcinomas[J].Int J Cancer,1994,56(6):826-829.

[7]Gotoh K,Yatabe Y,Sugiura,et al.Frequency of MAGE-3 gene expression in HLA-A2 positive patients with non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,1998,20(2):117-125.

[8]Hiroshi I,Masaki M,Jian L,et al.Human esophageal carcinomas frequently express the tumor-rejection antigens of MAGE genes[J].Int J Cancer,1995,63(4):523-526.

[9]van Baren N,Bonnet MC,Dreno B,et al.Tumoral and immunologic response after vaccination of melanoma patients with an ALVAC virus encoding MAGE antigens recognized by T cells[J].J Clin Oncol,2005,23(35):9008-9021.

[10]Yu JS,Liu G,Ying H,et al.Vaccination with tumor lysatepulsed dendritic cells elicits antigen-specific,cytotoxic T-cells in patients with malignant glioma[J].Cancer Res,2004,64(14):4973-4979.