絨毛細胞培養染色體分析及50例核型報道

王玉萍，浦 春，武其文

(皖南醫學院附屬弋磯山醫院檢驗科，安徽 蕪湖 241001)

染色體病是由于先天性的染色體數目及結構異常引起的疾病，新生活嬰染色體異常發生率約為0.73%，有效預防方法是行產前診斷進行出生前干預。介入性產前診斷的方法主要有絨毛、羊水、臍血染色體檢查[1]。絨毛染色體檢查適用于孕8～11周左右，能早期發現染色體異常，主要運用于及早進行診斷的應急病例和已停止發育的胎兒染色體分析。我們就絨毛染色體的培養、制作方法進行了探索，取得了滿意的結果。

一、材料和方法

1.病例來源 所有50例病例均來自于皖南醫學院附屬弋磯山醫院婦產科門診自然流產孕婦，在行清宮術時留取標本，其中第1次自然流產者31例，第2次自然流產者19例，年齡21～32歲之間，B超確認孕周為8～11周之間。

2.試劑 細胞培養液，GIBCO生產的AmnioMAXTM-Ⅱ;胰蛋白酶購自湖南湘雅生物技術有限公司;膠原酶Ⅱ購自BOMEI公司;秋水仙素購自廣州達暉公司;Giemsa染液購自湖南湘雅生物技術有限公司。

3.儀器 CO2培養箱由Thermo公司生產;超凈工作臺由蘇州安泰空氣技術有限公司生產;KX-21倒置顯微鏡、BX-51正置顯微鏡均為OLYMPUS公司生產。

4.方法 (1)標本留取:在孕8～11周流產孕婦負壓吸宮時，無菌操作吸取絨毛組織放入無菌培養皿，加入無菌生理鹽水約5 mL，清洗數遍即可。挑取絨毛約10 g放入另一培養皿，加入0.25%胰酶3 mL，再加入1%膠原酶Ⅱ6 mL，輕輕混勻，剪碎絨毛組織，放入37℃培養40 min;(2)標本培養:將上述懸液離心，棄去上清液，剩余約0.5 mL，加入細胞培養液5 mL，混勻，將混懸液吸入培養瓶中，置37℃ CO2培養箱培養;(3)細胞觀察:當培養至4～7 d，將培養瓶取出，置倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，若細胞生長良好，細胞克隆較多，即可進行換液;(4)收獲:當有較多圓形發亮的細胞出現時，即可收獲。加入秋水仙素1 h，將液體析出，加入預溫至37℃枸鹽酸鈉與胰酶9∶1配成的液體1 mL，反應3 min，再將之前的液體倒回，用細胞刮刀刮下瓶壁上的細胞，倒入刻度離心管離心，棄去上清液，低滲20 min，再經預固定、固定后滴片，75℃烘烤3 h，染色分析。

二、結 果

采用上述方法培養絨毛50例，檢出異常核型17例，異常核型檢出率34%，均為染色體數目異常。其中性染色體異常3例，常染色體異常14例，常染色體異常中多倍體2例，21-三體2例，非整倍體三體及單體10例。異常核型檢出情況見表1。

表1 50例絨毛異常核型檢出情況

三、討論

作為產前診斷的一部分，絨毛細胞培養染色體分析因牽涉到的環節多，胎兒流產后沒有再次復查的可能，使得其成為一項綜合性非常強的實驗技術。絨毛染色體技術包括直接制備和培養制備2種方法，直接制備由Simoni等[2]首次提出，但染色體分裂相對較少，易受母體污染，成功率較低;培養法獲得的染色體質量好，核型多，母體污染少，嵌合體少，成功率較高。其中最主要是掌握好胰酶消化絨毛的時間、細胞培養和收獲時間。以下幾點值得注意。

首先胰酶消化的時間要掌握好，時間過短細胞少，核型少不夠分析，時間過長細胞受到破壞，也會導致核型減少。本室消化40 min，效果滿意。

細胞長到4 d后，每天要進行觀察，如果細胞克隆多，可換液;如果細胞克隆少，可吹吸細胞克隆，使細胞脫落下來，再移入另一培養瓶內，繼續生長2～3 d，細胞克隆明顯增多。

收獲時時間要掌握好，當大多數克隆細胞密度較高、細胞形態好、折光度較好、其中有較多圓形發亮的細胞出現時，即可收獲，此時細胞已進入分裂中期，分裂相多。

絨毛細胞是胚胎外胚層細胞，具有與胚胎組織相同的遺傳性狀，利用絨毛染色體檢查技術可以了解胚胎細胞的遺傳學特點，為探討流產的原因提供依據。據報道，在早期胎兒自然流產病例中，染色體異常占50%以上[3]，本研究中50例核型中，發現異常核型17例，異常核型檢出率34%，均為染色體數目異常。其中性染色體異常3例，常染色體異常14例，常染色體異常中多倍體2例，21-三體2例，非整倍體三體及單體10例。染色體數目異常是導致胚胎早期流產的主要原因，因為染色體數目異常的胚胎，遺傳缺陷大，導致遺傳物質不平衡，致死性高[4]。本研究中異常核型檢出率低于報道，可能與標本例數較少有關，但也充分說明了染色體異常是導致孕早期自然流產的主要因素，因此臨床遇有孕早期出血孕婦，不宜盲目保胎。本研究未發現結構異常，有待于在今后的工作中繼續積累病例數進行統計。

絨毛染色體培養成功與否與檢測方法、標本采集、稽留時間均有關[5]，本室50例標本全部培養成功，這與嚴格掌握無菌操作、胚胎停止發育時間至吸宮時間短，流產絨毛標本新鮮有關。

綜上所述，嚴格控制操作條件，用上述方法培養絨毛細胞成功率高，獲得的分裂相多，該法可用于孕早期流產胎兒原因分析。

[1]王 昕，王樹玉.產前診斷方法及其進展[J].中國優生與遺傳雜志，2008，16(3):128-129.

[2]Simoni G，Brambati B，Danesino C，et al.Efficient direct chromosome analyses and enzyme determinations from chorionic villi samples in the first trimester of pregnancy[J].Hum Genet，1983，63(4):349-357.

[3]李 璞.醫學遺傳學[M].北京:人民衛生出版社，1989:96.

[4]孟 茜，王緒云.47例自然流產絨毛細胞培養及染色體核型分析[J].中國優生與遺傳雜志，2010，18(10):33.

[5]程麗村，趙欣榮，俞 青，等.絨毛染色體檢測在分析稽留流產原因中的運用[J].中國優生與遺傳雜志，2006，14(2):27.