蚯蚓GSH-Px提取與純化的研究

商桂娜，榮永海，榮 龍

北京航空航天大學生物與醫學工程學院，北京 100191

《本草綱目》中記載蚯蚓(earthworm)是通經活絡、活血化瘀、預防治療心腦血管疾病的重要藥物。近年來研究發現，蚯蚓體內存在著多種活性成分，從其體內提取的蚓激酶和抗菌肽等物質具有重要的醫用價值。另外有研究顯示，蚯蚓體內存在著多種抗氧化酶，谷胱甘肽過氧化物酶即為其中一種。谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，簡稱GSHPx)是存在于生物體內的重要的含硒酶。GSH-Px分子量為76～98 kD，由4個幾乎相同的亞基組成。GSH-Px主要的生理作用是清除有機氫過氧化物，并在過氧化氫酶含量很少或H2O2產量很低的組織中，可代替過氧化氫酶清除H2O2，所以該酶有防止畸變、預防衰老及參與前列腺素合成等重要作用［1］。

目前，國內的文獻是以人體肝臟［2］，洋蔥［3］等生物體為原材料進行了GSH-Px提取與純化;國外的文獻是以人體血液［4］，金槍魚肝臟［5］等生物體為原材料進行了GSH-Px提取與純化，但尚無從蚯蚓體內提取與純化GSH-Px的報道。由于動物的血液、肝臟均不易大批量獲得，且在提取的過程中需要抗凝措施等的處理，大大限制了GSH-Px的規模生產。本文利用蚯蚓進行GSH-Px的分離純化，擴大了GSH-Px原料的來源。

另外，近年來，GSH-Px 的提取多用勻漿［2，5］的方法。閃式提取法是中藥提取的一項新技術，其原理是在適當溶劑存在的條件下，利用高速機械剪切力和超速動態分子滲透作用，迅速破壞細胞組織，使組織細胞內部的化學成分或有效成分迅速達到組織內外平衡，通過過濾達到提取的目的。與傳統方法相比，具有高效、快速、不需加熱、不破壞成分、適宜各種溶劑等優勢［6］。已有報道將閃式提取技術應用于皂甙類物質的研究［7］，獲得較好的效果。在GSH-Px的提取方面還未見有閃式提取技術應用的報道。因此，閃式提取技術的應用是本研究的另一特點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和主要試劑

實驗用蚯蚓選用的品種為赤子愛勝蚓(Eisenia fetida)，由天津蚓福生物科技開發有限公司提供;硫酸銨購自國藥集團化學試劑有限公司;二乙胺基乙基纖維素(DEAE-Cellulose)購自上海躍騰生物科技有限公司;葡聚糖凝膠G-100(Sephadex G-100)購自美國Pharmacia公司;GSH-Px活性檢測用DTNB購自美國Sigma公司;蛋白檢測用牛血清蛋白購自北京奧博星生物技術有限公司;蛋白檢測用考馬斯亮藍G-250購自美國Amresco公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京賽馳生物科技有限公司，其余試劑均購自北京鼎國生物技術有限責任公司;全部試劑均為分析純或色譜純等級;所有溶液均以雙蒸水配制而成。

1.2 主要儀器與設備

JHBE-50型閃式提取器，河南金鼎科技發展有限公司;ArantiTMJ-25型低溫高速離心機，美國Beckman Coulter公司;868型酸度計，美國Orion公司;蛋白純化層析柱，上海錦華層析設備廠;FC-95A自動餾分收集器，北京新技術應用研究所;雙蒸水過濾器，美國PALL公司;SP-756P型分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 GSH-Px 的提取

1.3.1.1 超聲波提取法、組織勻漿法及閃式提取法提取蚯蚓GSH-Px的條件

取冷凍新鮮的蚯蚓(已洗凈)300 g，平均分為3份，剪碎，分別用超聲波提取法、組織勻漿法和閃式提取法進行提取。3種方法的提取條件如下:

超聲波提取條件為以純水為提取溶劑，料液質量比1∶3，功率為800 W，常溫下提取2次，每次30 min;

組織勻漿提取條件為以純水為提取溶劑，料液質量比1∶3，常溫下提取2次，每次30 s;

閃式提取條件為以純水為提取溶劑，料液質量比為1∶3，閃提轉速為3500 rpm，常溫下提取2次，每次30 s，每次間歇5 min。

提取完成后，置于-70℃ 冰箱冷凍12 h，取出融化，11000×g 4℃離心1 h，收集上清液即為GSH-Px粗提液，測定3種不同方法提取的GSH-Px的總活性。

1.3.1.2 閃式提取法提取蚯蚓GSH-Px條件的優化

本實驗通過單因素實驗確定了影響蚯蚓GSHPx提取的因素主要有料液比、提取液的pH值、閃提時間和閃提電壓并確定了各因素條件的適用范圍。為優選蚯蚓GSH-Px分離提取工藝，選取料液比(A)、提取液的pH值(B)和閃提時間(C)，設計3因素3水平L9(34)正交實驗，因素和水平表見表1。

表1 正交實驗因素和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

正交實驗共進行9組，每組取100 g冷凍新鮮(已洗凈)的蚯蚓，按正交實驗表中的條件進行閃式提取，提取完成后，置于-70℃ 冰箱冷凍12 h，取出融化，11000×g 4℃離心1 h，收集上清液，提取后每組測定GSH-Px總活性。

1.3.2 GSH-Px 的純化

1.3.2.1 硫酸銨沉淀

硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質。其原理是硫酸銨親水性大于蛋白質和酶分子的親水性，所以加入大量硫酸銨后，破壞了水膜，暴露出疏水區域，同時又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質分子即形成沉淀［8］。

將GSH-Px粗提液加入硫酸銨至50%的飽和度，在-20℃靜置1 h，11000×g 4℃離心40 min，棄上清液，沉淀用5 mmol/L，pH=7.2的磷酸鉀緩沖液(含1.4 mmol/L的β-巰基乙醇)溶解。然后在4℃下透析，先用蒸餾水透析1 h，然后用上述緩沖液透析2 h，測定透析后溶液中GSH-Px的總活性。

1.3.2.2 選擇性酸堿變性

該方法主要是利用蛋白質對pH值的穩定性不同而使雜蛋白變形沉淀［8］。將透析液調節pH 5.0，11000×g/min 4℃離心15 min，收集上清，將pH調到7.2，用5 mmol/L，pH=7.2 的磷酸鉀緩沖液(含1.4 mmol/L的β-巰基乙醇)4℃透析2 h，測定透析后溶液中GSH-Px的總活性。

1.3.2.3 DEAE-Cellulose 柱

DEAE-Cellulose柱是離子交換層析柱的一種，它利用不同的蛋白質的表面帶電部分與具有相反電荷的離子交換劑吸附強弱不同，因此所需的洗脫劑強度不同來進行物質分離［8］。

DEAE-Cellulose裝柱后用 5 mmol/L，pH=7.2的磷酸鉀緩沖液(含1.4 mmol/L的β-巰基乙醇)平衡。透析后的GSH-Px液上DEAE-Cellulose柱(1.6×30 cm)，然后用含有0～500 mmol/L NaCl的上述緩沖液進行梯度洗脫，流速為20 mL/h，每管收集10 mL收集酶活性峰。測定每管GSH-Px活性和蛋白質含量，收集活性較高的管，用5 mmol/L，pH=7.2的磷酸鉀緩沖液(含1.4 mmol/L的β-巰基乙醇)4℃透析2 h。

1.3.2.4 Sephadex G-100 柱

Sephadex G-100柱是凝膠過濾層析柱的一種，這種凝膠具有網狀結構，它利用蛋白質分子大小不同，進入網孔的程度不同，因此流出的速度不同，較大的分子先被洗脫下來，較小的分子后被洗脫下來，從而達到分離目的［8］。

Sephadex G-100 上柱后用5 mmol/L，pH=7.2的磷酸鉀緩沖液(含1.4 mmol/L的β-巰基乙醇)平衡，透析后的GSH-Px酶液經PEG-4000脫水后上Sephadex G-100柱(2.6×70 cm)。然后用上述緩沖液洗脫，分管收集，流速為20 mL/h，每管收集10 mL。測定每管GSH-Px活性和蛋白質含量，收集GSH-Px活性較高的管，得到GSH-Px純化后的樣品。

1.3.3 蚯蚓GSH-Px提取和純化的總工藝

圖1 蚯蚓GSH-Px提取與純化的工藝Fig.1 Extraction and purification process of earthworm GSH-Px

1.3.4 GSH-Px 活性檢測方法

采用DTNB直接法［9］，在GSH作為氫供體的條件下，GSH-Px可使H2O2還原為H2O。

酶活性單位定義:為1 mL蚯蚓提取液，37℃，pH=7.0條件下反應1 min，扣除非酶反應后，使GSH濃度下降1 μmol為1個酶活力單位。

1.3.5 蛋白質含量的測定方法

采用考馬斯亮蘭法(Bradford法)［10］，實驗以牛血清蛋白為標準蛋白質繪制標準曲線。

1.3.6 SDS-PAGE進行GSH-Px純度鑒定及亞基分子量的測定

采用SDS-聚丙烯酰胺垂直平板電泳進行GSHPx的純度鑒定并測定其亞基分子量，分離膠質量分數為12%，濃縮膠質量分數為5%，使用考馬斯亮藍G-250染色。

1.3.7 熱穩定性

將蚯蚓GSH-Px溶解在將蚯蚓GSH-Px溶解在pH=7.4，20 mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，然后分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃孵育1 h，測定酶活性。

1.3.8 pH 穩定性

將蚯蚓GSH-Px分別在100 mmol/L的pH 3.0～6.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、100 mmol/L的pH 7.0 ～8.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、100 mmol/L 的pH 9.0 ～ 11.0 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液在20℃水浴中孵育2 h，測定酶活性。

2 實驗結果

2.1 超聲波提取法、組織勻漿提取法和閃式提取法的比較

三種不同的提取方法提取條件及效果比較如表2所示。閃式提取法從100 g蚯蚓中提取的GSH-Px的酶總活力，高于超聲波提取法和組織勻漿法，但是與超聲法相比，提取時間顯著縮短。充分說明閃式提取效率高，提取速度快，是一種較為便捷的提取方法。

表1 不同提取方法提取條件和提取的GSH-Px的總活力比較Table 2 Comparison of extraction conditions of different extraction methods and the total activity of GSH-Px

2.2 閃提單因素實驗結果分析

2.2.1 料液比對蚯蚓GSH-Px總活力的影響

由圖2可知，在閃提緩沖液pH值為7.5，閃提時間為1 min，閃提電壓為110 V的條件下，料液比從1∶1到1∶4時，隨著料液比的增加，100 g蚯蚓中提取的GSH-Px的總活力也逐漸增加。料液比1∶4后提取的GSH-Px總活力增加不明顯。

2.2.2 pH值對蚯蚓GSH-Px總活力的影響

由圖3可知，在料液比為1∶4，閃提時間為1 min，閃提電壓為110 V的條件下，隨著pH值得升高，100 g蚯蚓中提取的GSH-Px的總活力呈現升高的趨勢，在pH 6.5后趨于穩定。

2.2.3 提取時間對蚯蚓GSH-Px總活力的影響

從圖4可以看出，在閃提料液比為1∶4，緩沖液pH值為7.5，閃提電壓為110 V的條件下，提取時間在1 min以內，100 g蚯蚓中提取的GSH-Px的總活力隨著提取時間的增加有顯著的增加;提取時間超過1 min后，收率基本無變化。

圖4 提取時間對于蚯蚓GSH-Px總活力的影響Fig.4 Effect of the extraction time on the total activity of GSH-Px

2.2.4 閃提電壓對蚯蚓GSH-Px總活力的影響

閃提電壓與轉速成正比，因此閃提電壓間接影響GSH-Px的提取效果。從圖5可以看出，在閃提料液比為1∶4，緩沖液pH值為7.5，提取時間1 min的條件下，100 g蚯蚓中提取的GSH-Px的總活力，受電壓影響很小，隨著電壓的增加，提取的酶活性基本穩定，因此，閃提取能耗最低的110 V作為提取電壓。

圖5 提取電壓對于蚯蚓GSH-Px總活力的影響Fig.5 Effect of the extraction voltage on the total activity of GSHPx

2.3 提取正交實驗結果與分析

以蚯蚓GSH-Px收率作為考察指標，選用L9(33)正交表安排實驗，實驗結果見表3，不考慮交互作用進行方差分析，實驗結果見表4。

從正交設計的結果，我們可以初步得知，影響蚯蚓體內GSH-Px提取的因素的主次順序是B＞A＞C，即提取緩沖液的pH值影響最大，然后是料液比，影響最小的提取時間。然后通過方差分析表4可以看出，閃式提取緩沖液的pH值對于GSH-Px的提取效果具有顯著性影響。正交設計優選的最佳條件為A3B3C1，即閃式提取物料加入6倍，pH=8.0的緩沖液，提取時間為1 min，分2次提取，每次30 s。

2.4 驗證試驗

按上述最佳條件A3B3C1進行3次驗證提取實驗，100 g蚯蚓中提取的GSH-Px的總活力分別為16524 u、15973 u、16206 u，平均為 16234 u。

表3 正交設計的結果Table 3 The results of orthogonal test

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.5 蚯蚓GSH-Px純化的結果

蚯蚓中GSH-Px的純化，結果總結于表5，DEAE-cellulose柱洗脫曲線見圖6，葡聚糖凝膠G-100柱洗脫曲線見圖7。經上述工藝后，GSH-Px的比活達到了157.08 U/mg，比活性在市售人類紅細胞GSH-Px(≥30 U/mg protein，Sigma)和市售牛紅細胞GSH-Px(≥300 U/mg protein，Sigma)之間。

表5 蚯蚓GSH-Px純化結果Table 5 Purification of earthworm GSH-Px

*回收率為每一步純化后，酶總活力占粗提液中酶總活力的百分比*Yield is defined as the percentage of the total activity after every purification step to the total activity of the crude extract

2.6 SDS-PAGE 電泳結果

純化的蚯蚓GSH-Px經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析后為單一條帶，測得其亞基分子量約為26 kD，實驗結果見圖 8。這與 Thompson JL 等［5］從南方藍鰭金槍魚肝臟中純化的GSH-Px(24 kD)相近。GSH-Px由4個相同亞基組成，因此推測本研究中純化的GSH-Px分子量約為104 kD，這與Awasthi YC等［4］從人紅細胞純化的GSH-Px分子量相近(95+3 kD)。

2.7 蚯蚓GSH-Px熱穩定性

實驗結果如圖9所示，GSH-Px的最適溫度為40℃，在20～40℃熱穩定性較好，溫度高于40℃時，酶活力顯著降低。這與徐蘅等［2］從人肝臟中純化的GSH-Px的性質相似:最適溫度為37℃，溫度高于45℃時，酶活力顯著下降;但與朱繼玲［3］從洋蔥中純化的GSH-Px有部分差異，其純化的GSH-Px在45℃之后，酶活性也顯著降低，但是在20～30℃時，其酶活性也相對較低。

圖9 蚯蚓GSH-Px的熱穩定性Fig.9 Thermal stability of earthworm GSH-Px

2.8 蚯蚓GSH-Px的pH穩定性

實驗結果如圖10所示，蚯蚓GSH-Px的pH 6～10范圍內相對穩定，這提示我們蚯蚓GSH-Px的提取純化、檢測以及實際應用中，pH值應盡量保持在6～10之間，以防止酶活性的大量丟失。這與徐蘅［2］等從人肝中純化的 GSH-Px(最適 pH為8.5，pH小于6時，酶活性顯著降低)性質相似。

另外，純化步驟中使用的選擇性酸堿變性的措施。雖然pH值低于6，對酶活性有一定影響，但是由于處理時間較短、活性損失較少、比活顯著提高，而且較上柱等其他處理措施相比，操作簡單、效率高，因此仍然將其用在了純化的步驟中。

圖10 蚯蚓GSH-Px的pH穩定性Fig.10 pH stability of earthworm GSH-Px

3 結論

在本研究中，我們首次使用蚯蚓作為原材料進行GSH-Px的提取，并確立了蚯蚓GSH-Px提取與純化的工藝。經過一系列的純化處理，獲得的樣品比活達到157.08 U/mg，回收率達到12.32%。另外，通過SDS-PAGE鑒定，純化的GSH-Px樣品為單一條帶，一個亞基的分子量為約為26 kD。

本研究在GSH-Px提取的過程中首次使用閃式提取技術，與傳統的提取方法勻漿法和超聲法相比，閃提具有時間短、效率高的優勢，更適合工業化生產的需要。

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