采用磁微粒分離酶聯免疫法構建基于KGN細胞的雌激素生物合成篩選模型

魯丹楓，Azimova Bahtigul Jovliqizi，張國林，王 飛*

1中國科學院成都生物研究所，成都 610041;2中國科學院研究生院，北京 100049;3烏茲別克斯坦科學院生物化學研究所，塔什干 10012，烏茲別克斯坦

雌激素是人體內一種重要的內源性物質，介導了許多重要的生理功能。雌激素主要有三類，活性最高的是雌二醇(17β-estradiol，E2)，其次是雌酮(estrone，E1)，活性最低的為雌三醇(estriol，E3)，其生物學效應主要通過與雌激素受體(estrogen receptor α/β)相結合，激活其轉錄或非轉錄活性，在生殖、免疫、骨骼、心血管和中樞神經統中發揮重要作用。雌激素缺乏常導致骨質疏松、冠心病、阿爾茨海默癥、肥胖等常見疾病，而雌激素相對過量則是諸多腫瘤(如乳腺癌)發生、發展、轉移等的直接原因［1］。生物體內，膽固醇通過一系列酶促反應合成雌激素，其限速步驟是由芳香化酶催化雄激素底物轉化為雌激素。芳香化酶在卵巢、脂肪組織及骨骼中均有表達，但在不同組織中使用不同啟動子，其調控機制也不一樣［2］。

在我國，隨著社會、經濟的發展，近十年來，許多老年性疾病(如心腦血管疾病、骨質疏松癥及乳腺癌)的發病率、死亡率和危險因素呈直線上升趨勢。例如，由骨質疏松癥導致的脊柱或胯骨骨折是老年人發病和死亡的一個主要原因［3］。乳腺癌已經是患病率最高的婦女惡性腫瘤，嚴重影響絕經后婦女的生活質量［4］。這些疾病的發生都與雌激素在機體內的合成代謝紊亂和/或其介導的信號途徑失調有關，因此發現新的雌激素合成調節劑對于這些重大疾病的治療具有重要意義。但目前受限于小分子化合物的檢測方法，針對雌激素合成的化合物篩選進展緩慢，嚴重限制了具有組織特異性的雌激素合成調節劑的發現。對于雌二醇的檢測分析，國內外學者進行了大量研究工作，建立了諸如TLC、GC/MS、HPLC等理化分析方法［5］。但這些方法操作比較繁瑣，不適用于大量樣本的篩選工作［6］。目前常用方法是以同位素標記的睪酮或雄烯二酮為底物，使用人胎盤微粒體或人重組芳香化酶蛋白［7］，或使用哺乳動物細胞系(如表達芳香化酶的人JEG-3或JAr細胞系)，通過測量3H-水釋放量，從而確定芳香化酶活性［8］。同位素方法的優點是所測結果可靠，檢測靈敏度高;缺點是操作復雜，需要專門的實驗設備和條件，成本高，難以做到高通量篩選。人卵巢顆粒細胞KGN細胞被發現表達較高水平的芳香化酶，由于缺乏17α-羥化酶，其本身并不產生睪酮或雌激素，且促卵泡激素(FSH)和福斯克林(Forskolin)可顯著促進細胞內芳香化酶表達，是進行雌激素合成研究的良好細胞［9，10］。采用非放射性雌激素ELISA方法，能有效地檢測出KGN細胞芳香化酶活性變化［9，10］，具有快速、簡便、靈敏、經濟的特點，適合大批量樣品檢測［11］。但這種基于聚苯乙烯基質的酶聯免疫法的抗體與聚苯乙烯材料是疏水性非特異性結合的，導致檢測靈敏度低，重復性不好。而磁微粒分離酶聯免疫法具有很多優點，例如磁微粒尺寸小、表面積大，共價交聯結合抗體，增加了抗原-抗體反應的效率，降低非特異性結合，檢測更快速，更精確［12，13］。

雖然磁微粒分離免疫法已用于檢測環境污染物中的雌激素［14，15］，但該方法在基于細胞的雌激素活性評價和篩選方面的應用尚有待進一步研究。本研究通過比較傳統的聚苯乙烯酶聯免疫法和磁微粒分離酶聯免疫法的檢測靈敏度和特異性差異，確定KGN細胞系的培養條件、底物睪酮處理濃度等因素，構建雌激素活性檢測的篩選模型。

1 材料和方法

1.1 材料

睪酮(T)、福美司坦(FOR)及福斯克林(FSK)買自 sigma化學公司(St.Louis，MO)。睪酮、福美司坦及福斯克林用DMSO溶解稀釋，配成終濃度為100 mmol/L的原始溶液，存放在-20℃?；衔锶芤河肈MSO依次梯度稀釋10倍。DMSO在培養基中的最終濃度為0.1%(v/v)。新生小牛血清、胎牛血清及活性炭/葡聚糖處理去除內源性激素的新生小牛血清買自 GIBCO公司。有、無酚紅的DMEM/F-12培養基買自Invitrogen公司。青鏈霉素、PBS及含EDTA的胰酶買自成都哈里生物公司。BCA蛋白檢測試劑盒買自上海Bestbio公司。

1.2 試劑盒

基于磁微粒分離酶聯免疫法的Ekozyme人雌二醇ELISA診斷試劑盒，北京，倍愛康生物技術有限公司?；诰郾揭蚁┗|酶聯免疫法的Cussabio人雌二醇ELISA試劑盒，武漢，華美生物技術有限公司。

1.3 細胞培養

KGN細胞系(解放軍總醫院，母義明教授提供，中國北京)在補充有5%(v/v)胎牛血清(GIBCO，Invitrogen)，青霉素(100單位/mL)及鏈霉素(0.1 g/L)的 DMEM/F-12 培養基(Invitrogen，Carlsbad，CA)，37℃，5%CO2的細胞培養箱中培養。

1.4 方法

1.4.1 芳香化酶活性檢測

根據文獻［10］并作適當修改，3×104KGN細胞/ml接種在24孔組織培養板中培養24 h。培養基更換成不含血清的、DMEM/F-12培養基，加入不同濃度測試化合物，培養24 h。加入底物睪酮，繼續培養24 h。吸取培養基及去除培養基后裂解細胞所得溶液存于-20℃。培養基13000 rpm，離心1 min，使培養基中細胞碎片等沉淀，獲得培養基上清液。用雌二醇檢測試劑盒定量培養基上清液中雌二醇量。所得結果經蛋白校正，表示為對照DMSO的百分數。用BCA蛋白檢測試劑盒定量裂解細胞所得溶液的蛋白含量。

1.4.2 檢測方法

按各種試劑盒的使用說明書進行操作。用Thermo Scientific Verioskan Flash多功能讀數儀檢測吸光度。

2 結果與討論

2.1 聚苯乙烯酶聯免疫法與磁微粒分離酶聯免疫法的底物特異性研究

以KGN細胞系為研究對象檢測雌二醇合成變化需要以睪酮為底物，而睪酮的化學結構與雌二醇的化學結構具有較高的相似性。因此，為了研究聚苯乙烯酶聯免疫法與磁微粒分離酶聯免疫法在雌二醇檢測中的特異性，我們檢測了這兩種試劑盒與底物睪酮的交叉反應。表1表明，這兩種酶聯免疫法的交叉反應都較低，睪酮幾乎不影響雌二醇檢測。即，基于聚苯乙烯酶聯免疫法的ELISA試劑盒與基于磁微粒分離酶聯免疫法的ELISA試劑盒的特異性都較高。

表1 雌二醇檢測法的交叉反應率Table 1 The cross-reactivity of polystyrene-and magnetic particle-based 17β-estradiol assay methods(%)

2.2 聚苯乙烯酶聯免疫法與磁微粒分離酶聯免疫法的靈敏度研究

為了確定聚苯乙烯酶聯免疫法與磁微粒分離酶聯免疫法雌二醇檢測靈敏度，使用這兩種ELISA檢測方法檢測DMSO、10 μmol/L福斯克林及50 μmol/L福美司坦處理KGN細胞系后芳香化酶活性變化情況［16-18］。圖1表明，同種處理條件，磁微粒分離酶聯免疫法檢測到更高的雌二醇量，芳香化酶活性變化更顯著。上述結果表明，與傳統的聚苯乙烯酶聯免疫法相比，磁微粒分離酶聯免疫法靈敏度更高，更適合于雌二醇檢測。

圖1 雌二醇檢測方法比較Fig.1 The sensitivity comparison of polystyrene-and magnetic particle-based 17β-estradiol assay methods

2.3 酚紅對雌二醇檢測的影響

培養基所含的酚紅用于指示培養基中CO2濃度變化，其顏色是粉紅色。為了確定酚紅顏色對檢測結果的影響，我們用聚苯乙烯酶聯免疫法(OD450)和磁微粒分離酶聯免疫法(OD550)測量PBS溶液及酚紅溶液的吸光度值，圖2表明，兩種雌二醇檢測方法中，酚紅溶液在檢測波長處的吸光度值都顯著大于PBS在對應波長處的吸光度值。上述結果表明，由于酚紅顏色干擾，導致檢測結果比真實結果更大。因此，應用不含酚紅的DMEM/F-12培養基接種KGN細胞系。

圖2 酚紅對雌二醇檢測結果的影響Fig.2 The effect of phenol red in the culture medium on quantification of 17β-estradiol in polystyrene-and magnetic particle-based 17β-estradiol assay methods

2.4 最適睪酮處理終濃度的研究

為了優化檢測體系的靈敏度，我們用基于磁微粒分離酶聯免疫法的ELISA試劑盒檢測底物睪酮與產物雌二醇間的濃度關系。圖3表明，當底物睪酮終濃度為10 nmol/L時，與DMSO相比，50 μmol/L福美司坦抑制了22%的芳香化酶活性，而10 μmol/L福斯克林增加了300%的雌二醇量。而其它睪酮處理濃度條件下，福斯克林或福美司坦激活或抑制芳香化酶活性的能力不顯著。這可能因為，基于磁微粒分離酶聯免疫法的雌二醇ELISA試劑盒測量范圍為0～11 nmol/L，底物睪酮處理終濃度過大，造成培養基中雌二醇量超過該方法的檢測極限。上述結果表明，底物睪酮處理終濃度為10 nmol/L時，基于磁微粒分離酶聯免疫法的ELISA試劑盒具有最佳檢測靈敏度。

圖3 睪酮濃度對雌二醇合成檢測結果的影響Fig.3 The effect of testosterone concentration on quantification of 17β-estradiol in magnetic particle-based 17βestradiol assay methods

2.5 篩選模型有效性研究

為了確定基于磁微粒分離酶聯免疫法的檢測體系有效性，我們檢測底物睪酮終濃度為10 nmol/L時，不同濃度芳香化酶抑制劑及激動劑對KGN細胞系雌激素合成的影響。如圖4所示，與不加底物睪酮相比，加入睪酮使培養基中雌二醇量增加了9倍，表明KGN細胞系有內源性芳香化酶蛋白表達。與加入睪酮處理的相比，加入不同濃度(1-10 μmol/L)陽性對照福斯克林，培養基中雌二醇生成量以濃度依賴方式增加，其中10 μmol/L福斯克林誘導培養基中雌二醇量增加了4.2倍左右。加入不同濃度(1～50 μmol/L)芳香化酶抑制劑福美司坦，雌二醇合成量以濃度依賴方式被抑制，其中50 μmol/L福美司坦抑制了30%左右的雌二醇合成量。以上結果表明我們成功建立雌激素篩選模型，可用于篩選雌激素合成調節劑。

圖4 KGN細胞系篩選模型有效性驗證Fig.4 The validation of the screen platform in human KGN cells

3 結論

通過比較傳統基于聚苯乙烯基質的酶聯免疫法及磁微粒分離酶聯免疫法的檢測特異性及靈敏度，我們發現，雖然聚苯乙烯酶聯免疫法與磁微粒分離酶聯免疫法的檢測特異性差別不大，但磁微粒分離酶聯免疫法的靈敏度更高，更適合于雌二醇檢測。通過進行酚紅對檢測結果影響及底物睪酮處理終濃度的研究發現，酚紅顏色干擾導致磁微粒分離酶聯免疫法的檢測結果變大，磁微粒分離酶聯免疫法的最適底物睪酮處理終濃度為10 nmol/L。通過檢測篩選模型有效性確定所構建的雌激素篩選模型，即在24孔組織培養板中，使用不含酚紅、含5%活性炭/葡聚糖處理去除內源性激素的新生小牛血清的DMEM/F-12培養基接種3×104KGN細胞/ml，培養24 h。加測試物處理KGN細胞系前，培養基更換成不含酚紅、不含血清的DMEM/F-12培養基;24小時后，加入終濃度為10 nmol/L底物睪酮，繼續培養24 h，用基于磁微粒分離酶聯免疫法的雌二醇ELISA試劑盒檢測培養基中雌二醇量。所建立的篩選模型避免采用放射性底物，環境友好，成本較低，適用于基于細胞的雌激素生物合成活性評價和高通量篩選，對篩選和發現具有組織特異性的雌激素合成調節劑具有重要意義。

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