高效液相色譜法測定塞來昔布中三氟乙酸殘留

于偉 雋海龍 王偉 史紅霞

高效液相色譜法測定塞來昔布中三氟乙酸殘留

于偉 雋海龍 王偉 史紅霞

目的 建立高效液相色譜法測定塞來昔布中三氟乙酸的殘留含量。方法 色譜柱：采用Hypersil ODS柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 檢測波長210 nm, 流動相：0.08%磷酸溶液(Ph 3.0)-甲醇(95:5),流速1.0 ml/min,柱溫：35℃。結果 三氟乙酸濃度在 2.05～12.12 μg/ml范圍內, 線性關系良好, r=0.9998;檢測限為 1.0 ng;加樣回收率平均為 98.57%, RSD 為 0.99%。結論 此法可用于塞來昔布中三氟乙酸含量的測定, 準確度高。

塞來昔布；高效液相色譜法；三氟乙酸；含量測定

塞來昔布(4-［5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基］苯磺酰胺)是第一個在骨關節炎和風濕病的治療中起作用的COX-2抑制劑［1,2］。這個藥與傳統的非類固醇性抗炎劑聯用時無通常的副作用。GD Searle研發出了塞來昔布, 目前市場上商品名為西樂葆。

在塞來昔布的合成工藝中, 一般以對甲基苯乙酮和三氟乙酸乙酯經Claisen縮合反應制得中間體, 然后與對苯磺酰胺基苯肼鹽酸鹽化合制得塞來昔布。由于三氟乙酸乙酯會水解生產三氟乙酸, 因此在塞來昔布原料藥的質量標準中, 對三氟乙酸限量有明確要求, 進口注冊標準中規定三氟乙酸不得超過0.04%。本實驗建立了高效液相色譜法(HPLC) 測定塞來昔布中三氟乙酸殘留的方法。

1 材料

塞來昔布, 江蘇正大清江制藥有限公司提供, 批號: 20121029、 20121103、 20121109、 20121118；三氟乙酸對照品( 色譜純) , 美國天地試劑有限公司；甲醇( 色譜純) , 江蘇漢邦科技有限公司; 其余試劑均為市售分析純。美國Waters Alliance 2695 高效液相色譜儀, 2487紫外可變波長檢測器, Empower 2色譜工作站。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱: Hypersil ODS 柱( 4.6 mm × 250 m m, 5 μm) ; 流動相: 0.08% 磷酸溶液( pH 3.0) - 甲醇( 95:5) ; 流速: 0.8 ml/min; 檢測波長: 210 nm; 柱溫: 35 ℃ ; 進樣量: 20 μl。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制 取三氟乙酸對照品適量, 精密稱定, 加流動相溶解并制成每 1 ml 中含三氟乙酸10.1 μg的溶液, 作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取塞來昔布適量, 精密稱定, 加流動相溶解并制成每 1 ml中含塞來昔布 25 mg 的溶液, 作為供試品溶液。

2.3 測定方法 精密量取對照品溶液和供試品溶液各20 μl,分別注入液相色譜儀。記錄色譜圖( 見圖 1) , 按外標法以峰面積計算供試品溶液中三氟乙酸的含量。

圖 1 塞來昔布中三氟乙酸測定的HPLC色譜圖

2.4 加樣回收率測定 用加樣回收法, 精密量取供試品溶液 250 mg, 置10 ml量瓶中, 加流動相稀釋至刻度, 搖勻, 作為回收試驗用空白溶液(濃度為25 mg/ml) ,另精密量取塞來昔布樣品250 mg分別用含三氟乙酸 8.08、10.10、12.12 μg/ ml的對照溶液溶解并定容到10 mL 量瓶中,釋至刻度, 搖勻,作為回收率測定溶液, 按2.3項方法分別測定, 并計算回收率,測定結果見表1。平均回收率為98.57%, RSD( n= 9) 為0.99%。

表1 回收率試驗測定結果表

2.5 線性范圍 取三氟乙酸對照品適量, 精密稱定, 加流動相溶解并分別稀釋制成、2.02、4.04、6.06、8.8、10.10、12.12 μg/ ml的溶液, 依次進樣20 μl, 記錄色譜圖, 以峰面積(Y)為縱坐標, 濃度(X, g/ml) 為橫坐標, 進行線性回 歸。回歸方程: Y = 958.75X-90.07, r=0.9998, 線性范圍為2.05～12.12 μg/ml。

2.6 精密度測定 取塞來昔布( 批號：20121029) 適量, 精密稱定, 加流動相溶解并制成每 1 ml 中含塞來昔布25 mg的溶液,作為供試品溶液, 共配制 6 份, 按2.3項方法分別測定三氟乙酸的含量,均未檢出。

2.7 檢測限 取三氟乙酸對照品適量, 精密稱定, 加流動相溶解并稀釋制成1.01 μg/ml 的溶液, 進行測定, 信噪比 S/N=3,測得三氟乙酸的檢測限為1.0 ng。

2.8 塞來昔布中三氟乙酸含量測定取塞來昔布4批( 批號: 20121029、 20121103、 20121109、 20121118) , 按 2.3 項方法測定三氟乙酸的含量, 結果均未檢出。

3 討論

目前三氟乙酸含量測定的方法多采用氣相色譜法［3］, 由于三氟乙酸的極性大, 酸性強, 對氣相色譜柱損傷大, 分析成本較高, 且效果不是很理想。而用氧瓶燃燒法測定氟的含量［4,5］, 操作繁瑣且誤差較大, 且塞來昔布樣品本身含有氟元素干擾樣品檢測。另據報道［6］, 也可考慮用強酸型陽離子交換色譜柱測定三氟乙酸的含量, 本文采用 C18色譜柱分離測定塞來昔布中三氟乙酸的含量, 方法簡便, 準確度高。在三氟乙酸對照品的配制過程中, 因三氟乙酸極易揮發, 故在稱量過程中, 量瓶內應先加入適量流動相, 再加入三氟乙酸后需充分振搖, 使三氟乙酸充分溶解于流動相中, 減量法稱樣比較準確。

在整個試驗過程中, 塞來昔布主峰未能洗脫出來, 多次進樣尚未發現其對三氟乙酸測定有干擾, 因此, 應對色譜柱進行清洗后再保存。

［1］ Simon L S,Lanza F L,Lipsky P E,et al.Preliminary study of the safety and efficacy of SC-58635, a novel cyclooxygenase 2 inhibitor: efficacy and safety in two placebo-controlled trials in osteoarthritis and rheumatoid arthritis, and studies of gastrointestinal and platelet effects.Arthritis & Rheumatism, 1998, 41(9): 1591-1602.

［2］ Goldstein J L, Silverstein F E, Agrawal N M, et al.Reduced risk of upper gastrointestinal ulcer complications with celecoxib, a n ovel COX-2 inhibitor.The American journal of gas troenterology, 2000, 95(7): 1681-1690.

［3］ 孟靜娟,單風平.氣相色譜法測定液相合成蛋酸腦啡肽中雜質殘留量.微生物學雜志,2008,28( 3) : 106 -108.

［4］ 顏冬梅.人發中微量氟的測定.醫療保健器具, 2008, 15(9):74-75.

［5］ 張莉,晁若冰.有機藥物中殘留三氟醋酸測定方法的研究.華西藥學雜志, 2001,16(6):427-428.

［6］ 高春,高恒瑩,姚瑛,等.高效液相色譜法測定醋酸奧曲肽中醋酸含量.中國生化藥物雜志, 2004, 25(4):237 -238.

Determination of trifluoroacetic acid in celecoxib by HPLC

YU Wei, JUAN Hai-long, WANG Wei, et al.Huaian City High-tech Business Center, Huaian 223001, China

Objective To establish a HPLC method for determination of the content of trifluor oacetic acid in celecoxib.Methods Hypersil ODS column(4.6 mm×250 mm, 5 μm) and 0.08% phosphoric acid so -lution( pH 3.0)-methanol( 95:5) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 ml/ min were used with a column temperature of 35℃ and detection wavelength of 210 nm.Results The standardcurve of trifluoroacetic acid was linear in the range of 2.05～12.12 μg/ml, r= 0.9998.The detection limit was 1.0 ng.The average recovery rate of method was 98.57%, and RSD was 0.99% .Conclusion The method of content determination is practicable and accurate.It can be used for content determination of trifluoroacetic acid in celecoxib.

Celecoxib；HPLC；Trifluoroacetic acid; Content determination

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