火炮打擊兔應(yīng)激防護(hù)模型腦組織病理及NMDA-R1表達(dá)的形態(tài)學(xué)研究

周龍 張建華 林進(jìn)皇 俞雄杰 郁毅剛

火炮打擊兔應(yīng)激防護(hù)模型腦組織病理及NMDA-R1表達(dá)的形態(tài)學(xué)研究

周龍 張建華 林進(jìn)皇 俞雄杰 郁毅剛

目的 探討實(shí)彈演習(xí)火炮打擊后, 不同位置掩體保護(hù)下兔腦組織病理及NMDA-R1表達(dá)的變化。方法 閩南山地團(tuán)進(jìn)攻演習(xí), 30只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為空白對(duì)照組, 反角隱蔽組和迎面隱蔽組。火炮打擊應(yīng)激損傷后6 h, 各組存活兔取腦組織, 觀察其病理損傷形態(tài)學(xué)及NMDA-R1表達(dá)的變化。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較, 反角隱蔽組和迎面隱蔽組NMDA-R1表達(dá)強(qiáng)陽性, 腦組織結(jié)構(gòu)層次被破壞, 神經(jīng)細(xì)胞變性壞死, 間質(zhì)出血；迎面隱蔽組NMDA-R1免疫反應(yīng)強(qiáng)度亦高于反角隱蔽組。結(jié)論 火炮打擊后兔腦組織應(yīng)激損傷反應(yīng)強(qiáng)烈, 反角掩體保護(hù)能夠減輕腦組織損傷, NMDA-R1參與腦組織損傷病理過程。

火炮打擊；兔；應(yīng)激防護(hù)模型；腦組織；NMDA-R1

正常情況下機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)是有利的, 有助于機(jī)體快速適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境因素的變化, 但過大過長的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有害的影響, 產(chǎn)生病理性應(yīng)激［1］。病理性應(yīng)激是機(jī)體對(duì)嚴(yán)重應(yīng)激因素(如創(chuàng)傷、打擊、爆炸等)的一種異常反應(yīng),其生理過程主要表現(xiàn)為下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamopituitary-adrenal, HPA)軸神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能紊亂, 導(dǎo)致持續(xù)過度的糖皮質(zhì)激素升高［2］。近年來, 人們發(fā)現(xiàn)N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAr)的變化與創(chuàng)傷后神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能紊亂的發(fā)生機(jī)制有關(guān)［3］。本課題通過建立火炮打擊兔應(yīng)激防護(hù)模型, 進(jìn)行應(yīng)激狀態(tài)下兔腦組織病理變化及NMDA-R1表達(dá)的形態(tài)學(xué)研究, 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、動(dòng)物及試劑 團(tuán)進(jìn)攻炮火覆蓋火力類型：武裝直升機(jī)火箭彈、XX自行榴彈炮、XX牽引加農(nóng)炮、XX自行火箭炮、水陸兩棲坦克、XX輪式突擊炮、XX迫擊炮、XX反坦克導(dǎo)彈。健康成年日本大耳白兔30只, 雌雄不拘,清潔級(jí), 體質(zhì)量2.5～3.0 kg(廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供),隨機(jī)表法分為3組, 空白對(duì)照組6只, 反角隱蔽組6只, 迎面隱蔽組18只(距離攻擊目標(biāo)10 m隱蔽組6只, 20 m隱蔽組6只, 3 0 m組隱蔽6只)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 按照文獻(xiàn)［4］方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)時(shí)間和環(huán)境條件為南方秋季中午山地環(huán)境, 環(huán)境溫度16℃～28℃, 濕度43%～65%。實(shí)驗(yàn)兔常規(guī)喂養(yǎng), 演習(xí)當(dāng)日凌晨運(yùn)至目標(biāo)高地,炮靶前迎面10 m、20 m、30 m處挖掘約1 m深掩體, 各放置實(shí)驗(yàn)兔6只, 上覆蓋硬質(zhì)木板、松枝, 留通氣道。炮靶后反角10 m處挖掘同樣掩體, 放置實(shí)驗(yàn)兔6只。空白對(duì)照組于炮靶陣地外10 km營區(qū)喂養(yǎng)。中午演習(xí)開始, 全過程2 h。轟炸機(jī)俯沖(未投彈), 持續(xù)火炮急襲5 min。各型火炮、坦克、導(dǎo)彈、武裝直升機(jī)集群連續(xù)發(fā)彈若干, 期間暫停兩次, 各10 min。演習(xí)結(jié)束, 工兵排爆清理陣地后進(jìn)場(chǎng)取回實(shí)驗(yàn)兔。傷后6 h處死存活兔解剖, 取腦組織標(biāo)本, 4%甲醛固定。

1.3 腦組織病理檢測(cè) 取4%甲醛固定腦組織, 石蠟包埋,切片行HE染色, 光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化, 由同一病理醫(yī)生采用盲法評(píng)價(jià)。觀察腦組織結(jié)構(gòu)層次是否完整, 神經(jīng)細(xì)胞腫脹、變性、壞死, 間質(zhì)出血、水腫等情況。

1.4 腦組織NMDA-R1免疫組化表達(dá)的測(cè)定 取4%甲醛固定腦組織, 石蠟包埋, 連續(xù)切片(4 μm), 每例標(biāo)本切5張免疫組化染色用。采用改進(jìn)型SP法進(jìn)行免疫組化染色, 嚴(yán)格參照試劑盒說明操作。試劑盒型號(hào), 購于XX公司。每次染色時(shí)均用已知陽性切片作陽性對(duì)照, 用PBS(磷酸緩沖液, 0.01 mol/L, pH值7.2)代替一抗作陰性對(duì)照。NMDA-R1表達(dá)均位于胞質(zhì)和胞核內(nèi), 表現(xiàn)為淺黃、棕黃或棕褐色。用半定量法評(píng)估其染色, 無陽性細(xì)胞數(shù)為(-), 陽性細(xì)胞數(shù)25%以下為(+), 25%～50%為(++), 51%～75%為(+++), 超過75%為(++++)。

2 結(jié)果

2.1 兔一般情況 各組實(shí)驗(yàn)兔均無直接火力命中。與空白對(duì)照組比較, 反角隱蔽組實(shí)驗(yàn)兔全部存活, 部分精神萎靡,反應(yīng)遲鈍, 伏地, 少部分耳道出血。因彈著點(diǎn)不規(guī)律, 迎面隱蔽3組距離無差異, 合并為1組。迎面隱蔽組18只實(shí)驗(yàn)兔當(dāng)場(chǎng)死亡9只, 至傷后6 h取腦組織標(biāo)本前再死亡3只,死亡率達(dá)66.7%(12/18)。剩余6只存活實(shí)驗(yàn)兔編為迎面隱蔽組, 與另外兩組同時(shí)刻點(diǎn)取腦組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)及組化檢測(cè), 每只取五張切片進(jìn)行組化表達(dá)強(qiáng)度及形態(tài)學(xué)觀察研究。

2.2 腦組織HE染色結(jié)果 空白對(duì)照組腦組織切片HE顯示, 分子層, 內(nèi)、外顆粒層及錐體細(xì)胞層結(jié)構(gòu)完整, 均勻致密；錐體細(xì)胞數(shù)量豐富, 胞體致密, 核居中, 軸突完整、干凈,向四周延伸；間質(zhì)為少量血管及白質(zhì), 肌漿深染, 膠質(zhì)豐富,可見散在分布血管, 腔內(nèi)可見少量紅細(xì)胞, 未見炎癥細(xì)胞(圖1、圖2)。反角隱蔽組腦組織切片HE顯示, 分層結(jié)構(gòu)存在,錐體細(xì)胞數(shù)量減少, 胞體稍腫脹, 可見空泡變性, 軸突斷裂；細(xì)胞間少量紅細(xì)胞分布, 間質(zhì)少量炎細(xì)胞浸潤(圖3、圖4)。迎面隱蔽組腦組織切片HE染色顯示, 細(xì)胞結(jié)構(gòu)層紊亂, 分界不清, 部分壞死, 崩解；細(xì)胞數(shù)明顯減少, 胞體腫脹, 體積增大, 軸突消失, 白質(zhì)稀疏；間質(zhì)充血, 可見散在紅細(xì)胞分布及漿細(xì)胞浸潤(圖5、圖6)。

2.3 腦組織NMDA-R1免疫組化的表達(dá) 各組神經(jīng)元錐體細(xì)胞中均有NMDA-R1表達(dá), 主要在神經(jīng)元膜表面表達(dá), 免疫反應(yīng)強(qiáng)度有差異。空白對(duì)照組可見神經(jīng)元形態(tài)完整、胞膜淡染, NMDA-R1蛋白少量表達(dá)(+)(圖7、圖8)。反角隱蔽組可見神經(jīng)元胞體腫脹, 細(xì)胞數(shù)量減少, 細(xì)胞膜典型黃染, NMDA-R1中量表達(dá)(++)(圖9、圖10)。迎面隱蔽組, 可見大量神經(jīng)元壞死崩解, 殘存神經(jīng)元形態(tài)數(shù)量稀少, 胞體腫脹, 體積巨大, 胞核溶解, 大部分胞質(zhì)、胞膜均黃染, 色深, NMDA-R1大量表達(dá)(++++)(圖11、圖12)。迎面隱蔽組、反角隱蔽組NMDA-R1免疫反應(yīng)強(qiáng)度均高于對(duì)照組, 同時(shí)迎面隱蔽組NMDA-R1免疫反應(yīng)強(qiáng)度亦高于反角隱蔽組。

圖1 空白組HE染色(×100)

圖2 空白組HE染色(×400 )

圖3 反角組HE染色(×100)

圖4 反角組HE染色(×400)

圖5 迎面組HE染色(×100)

圖6 迎面組HE染色(×400 )

圖7 空白組Nr1組化(×100)

圖8 空白組Nr1組化(×400)

圖9 反角組Nr1組化(×100)

圖10 反角組Nr1組化(×400)

圖11 迎面組Nr1組化(×100)

圖12 迎面組Nr1組化(×400)

3 討論

爆炸及爆炸應(yīng)激性腦損傷是戰(zhàn)爭(zhēng)中人員遭受的一種多發(fā)而又嚴(yán)重的顱腦損傷, 在美軍近年的軍事行動(dòng)中, 爆炸沖擊波性腦損傷的發(fā)生率約為40%～60%, 約有32萬服役人員或戰(zhàn)士遭受過爆炸沖擊波腦損傷［5］, 即使爆炸外圍沒有直接受到?jīng)_擊波影響的戰(zhàn)士, 也因爆炸應(yīng)激性損傷而導(dǎo)致腦組織及細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的生理病理變化［6］。有報(bào)道顯示［2］, HPA軸系統(tǒng)在應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控中的作用與NMDA-R活化有著密切的聯(lián)系。因此, 為了了解爆炸及爆炸應(yīng)激狀態(tài)下腦組織損傷的病理生理機(jī)制, 作者建立火炮打擊兔應(yīng)激防護(hù)模型, 進(jìn)行應(yīng)激狀態(tài)下兔腦組織病理變化及NMDA-R1表達(dá)的形態(tài)學(xué)研究。結(jié)果提示：與空白對(duì)照組比較, 反角隱蔽組和迎面隱蔽組腦組織病理切片及免疫組化均可見腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)層紊亂, 部分神經(jīng)元變性、壞死、崩解, 細(xì)胞數(shù)減少, 胞體腫脹, 體積增大, 胞核溶解, 細(xì)胞間質(zhì)充血, 漿細(xì)胞浸潤等腦組織損傷的病理表現(xiàn), 并且迎面隱蔽組上述表現(xiàn)更明顯和嚴(yán)重。同時(shí), 迎面隱蔽組腦組織NMDA-R1大量表達(dá)(++++), 反角隱蔽組腦組織NMDA-R1中量表達(dá)(++), 而空白對(duì)照組腦組織NMDA-R1少量表達(dá)(+), 與腦組織病理損傷結(jié)果具有一致性。以上結(jié)果表明, NMDA-R1參與了爆炸及爆炸應(yīng)激狀態(tài)下腦組織病理損傷過程。

NMDA-R是一種興奮性氨基酸的特異性離子型受體, 它與學(xué)習(xí)、記憶及神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育的可塑性都有密切關(guān)系,主要分布于大腦皮層、丘腦、紋狀體、海馬等的突出后膜上, NMDA-R通道對(duì)Ca2+具有高度通透性, 在正常生理?xiàng)l件下, 由于離子通道內(nèi)部Mg2+的阻滯作用, 通道并不開放［7,8］。NMDA-R參與興奮性突觸傳遞、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等生理活動(dòng),其參與腦組織病理損傷的機(jī)制為：①NMDA-R1激活HPA軸促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的分泌和釋放。Son等［9］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)應(yīng)激狀態(tài)下腦海馬內(nèi)NMDA-R1水平存在明確的改變。嚴(yán)重創(chuàng)傷應(yīng)激后海馬NMDA-R激活, 下調(diào)海馬糖皮質(zhì)激素受體進(jìn)而影響糖皮質(zhì)激素在海馬水平的負(fù)反饋調(diào)節(jié), 導(dǎo)致HPA軸亢進(jìn), 內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素過度增多［10,11］。現(xiàn)已證實(shí), 過度升高的內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素是病理性應(yīng)激損傷的主要因素之一, 影響神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性［12］。②介導(dǎo)興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì), NMDA-R是其特異性離子型受體, 腦損傷時(shí)腦細(xì)胞外谷氨酸濃度大量增加, NMDA-R1迅速被激活, 并誘導(dǎo)神經(jīng)元興奮毒性、激發(fā)神經(jīng)元的退化及神經(jīng)細(xì)胞死亡等過程。岳少杰等［13］研究表明谷氨酸可致膠質(zhì)細(xì)胞的腫脹、壞死及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡；Ros等［14］也報(bào)道谷氨酸可導(dǎo)致大腦皮層損害。③參與繼發(fā)性腦組織水腫及創(chuàng)傷應(yīng)激產(chǎn)物的形成。有報(bào)道證實(shí)［15］：NMDA-R1過度激活可介導(dǎo)Na+主動(dòng)內(nèi)流,隨即Cl-、水被動(dòng)內(nèi)流, 神經(jīng)細(xì)胞急性滲透性腫脹；同時(shí), 其過度興奮介導(dǎo)的神經(jīng)元遲發(fā)性損傷, 以Ca2+內(nèi)流為特征并激活膜磷脂酶活性, 引起白細(xì)胞三烯、前列腺素和花生四烯酸等產(chǎn)生增多, 導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和自由基形成, 激活各種蛋白酶導(dǎo)致細(xì)胞骨架降解, 細(xì)胞裂解。④介導(dǎo)炎癥反應(yīng)性損傷, NMDA-R數(shù)量的增加可導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)炎癥的敏感化, 加重繼發(fā)性炎癥反應(yīng)性腦損傷, 而NMDA-R在神經(jīng)細(xì)胞膜上的表達(dá)量是調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞炎癥應(yīng)激強(qiáng)度的關(guān)鍵［16］。

綜上所述, 通過觀察實(shí)彈演習(xí)對(duì)火炮打擊兔應(yīng)激防護(hù)模型的實(shí)驗(yàn)研究, 作者探討戰(zhàn)場(chǎng)環(huán)境下火炮打擊應(yīng)激復(fù)合損傷-保護(hù)因素對(duì)腦組織病理損傷的特點(diǎn), 為戰(zhàn)爭(zhēng)環(huán)境下顱腦爆炸沖擊及爆炸應(yīng)激傷的診治提供了新的思路。

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Morphological study on NMDA-R1 expression and pathology research on injury brain tissue of artillery attacking stress protective rabbits model

ZHOU Long, ZHANG Jian-hua, LIN Jin-huang, et al.Department of Trauma Neurosurgery, 175th Hospital of PLA Dongnan Hospital Affiliated to Xiamen University, Zhangzhou 363000, China

Objective To study the NMDA-R1 expression and pathology on injury brain tissue in rabbits hidden in different positions of blindage after real artillery attacking in battlefield.Methods 30 Japanese white rabbits were randomly divided into 3 groups, blank group, reverse hidden group and frontage hidden group in mountain regiment artillery attacking maneuver at southern of Fujian.The NMDA-R1 expression and pathology on injury brain tissue in rabbits were observed and recorded in 6 hours after injury.Results Compared with the blank group, the NMDA-R1 expression in reverse hidden group and frontage hidden group were strong positive, brain tissue structure were destroyed, nerve cells degeneration necrosis and brain tissue i nterstitial hemorrhage.Tthe NMDA-R1 expression in frontage hidden group were stronger than reverse hidden group.Conclusion The stress injury response is very strong in rabbits attacked by artillery, reverse blindage protection can reduce degree of brain tissue injury, NMDA-R1 participates in brain tissue injury pathological process.

Artillery attack; Rabbit; Stress protective model; Brain tissue; NMDA-R1

全軍十一五醫(yī)學(xué)科研基金面上項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：06MB152)；福建省漳州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：Z10071)；南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：12MA065)

363000 漳州,解放軍第一七五醫(yī)院暨廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院神經(jīng)外科(周龍 林進(jìn)皇 郁毅剛)；解放軍73131部隊(duì)(張建華 俞雄杰)

郁毅剛 E-mail：yu-yg@tom.com