流感病毒感染對慢性阻塞性肺疾病患者氧化應激和全身炎性反應的影響

盧文宣 張明泳 韓 偉 唐華平 (青島大學醫學院附屬青島市市立醫院東院呼吸科，山東 青島 266071)

越來越多的證據顯示慢性阻塞性肺病急性加重(Acute Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，AECOPD)與病毒性呼吸道感染有關［1］。由于經常變異，即便常見的呼吸道病毒也可能引發嚴重的肺部病變，甚至死亡。阻斷病毒損傷的關鍵步驟是目前治療嚴重病毒感染的重要策略。本研究調查流感病毒感染AECOPD患者的氣道氧化應激改變及其與病情的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2011年10月1日～2012年10月1日連續就診青島市市立醫院東院呼吸科就診的可疑病毒感染的中度AECOPD患者200例，其中男142例，女58例，年齡52～86歲，平均(73.90±9.83)歲，病程3～40年。COPD和AECOPD診斷標準參考2003版GOLD指南［2］。患者依次進行血常規、血內毒素(BET)、痰培養、胸部X線和肺功能檢查。同時符合以下條件者可入選研究:①無膿性痰;②血液白細胞＜10×109/L;③內毒素(BET)正常;④痰細菌培養陰性;⑤X線檢查排除肺內其他病變;⑥肺功能檢查(MedGraphic肺功能儀，美國):支氣管舒張試驗陰性，FEV1/FVC＜70%，支氣管舒張劑前60%＜FEV1% ＜80%。另外選擇20例中度COPD穩定期患者作為對照組。

1.2 呼吸道分泌物采集與處理:參考文獻［3］。在就診當日留取痰標本。加入等體積含0.1%DTT的PBS液中震蕩2 min，37℃水浴15 min，1 500 r/min低速離心取上清液，置-20℃保存。

1.3 呼吸分泌物病毒測定:根據GeneBank數據庫中流感病毒核苷酸序列，參照相關文獻［4］，用Primer express 5.0軟件設計引物，流感病毒A引物序列如下:F:5'-GACCRATCCTGT-CACCTCTGAC-3';R:5'-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3'產物長度:108 bp。以RNase P作內參:F:5'-AGATTTGGACCTGCGAGCGR-3':5'-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3'。反應體系總體積為 25 μl，具體如下:10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP Mix 2.5 μl，上游引物、下游引物各 1 μl，DNA Polymerase 0.2 μl，模板 DNA 1 μl，加 水補足至 25 μl。反應參數:95℃ 10 min ，95℃ 15 s，55℃ 31 s，72℃ 30 s，共35個循環，每次擴增均設立陽性對照和陰性對照。上述RTPCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。采用美國Gene Genius凝膠電泳成像系統測出目的基因和內參的表達強度，計算校正后目的基因表達強度(目的基因表達強度/內參表達強度)。

1.4 呼吸道氧化應激因子測定:取痰上清液，按參考文獻［3］，分別以WST-1法測定超氧化物岐化酶(SOD)和硫代巴比妥法測定脂質過氧化產物丙二醛(MDA)。SOD檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒由南京建成生物有限公司提供。

1.5 血漿炎性因子測定:取患者空腹血3 ml放于抗凝管中，靜置30 min后離心取血漿。以IL-6和IL-8 ELISA試劑盒(R＆D)按說明書步驟測定IL-6和IL-8等炎性相關因子水平。

2 結果

2.1 患者分組和一般情況:共有25例患者痰液檢出流感病毒，劃入流感組。流感組和對照組在性別、年齡、吸煙史、COPD病史方面差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組患者一般情況對比

2.2 兩組痰液中SOD和MDA水平比較:兩組患者痰中SOD、MDA水平見表2。統計顯示，流感組的MDA高于對照組，而流感組的SOD低于對照組，組間差別均有統計學意義(P﹤0.05)。

2.3 兩組血漿炎性因子比較:兩組患者血漿IL-6和IL-8水平見表3。統計顯示，流感組的IL-6和IL-8水平高于對照組，組間差別均有統計學意義(P﹤0.05)。值得注意的是，流感組IL-8水平與MDA水平成正相關(r=0.463，P=0.020)，見圖1。

2.4 病毒表達強度與痰液氧化應激水平的關系:流感組流感病毒的校正后平均表達強度為0.66±0.07，統計發現，在流感組內，流感病毒表達強度與痰MDA成正相關(r=0.557，P﹤0.05，圖2)，提示流感病毒感染與氣道氧化應激水平增強有關。

表2 兩組患者痰MDA、SOD的水平(±s)

表2 兩組患者痰MDA、SOD的水平(±s)

注:與對照組比較，①P＜0.05

組別 例數 MDA(nmol/ml) SOD(U/ml)流感組 25 6.64±1.22① 58.47±6.79①對照組 20 3.43±1.24 65.47±10.25 t值 2.22 2.75 P值 ﹤0.05 ﹤0.05

表3 兩組患者IL-6和IL-8的水平(±s)

表3 兩組患者IL-6和IL-8的水平(±s)

注:與對照組比較，①P＜0.05

組別 例數 IL-6(pg/ml) IL-8(ng/ml)流感組 25 67.89±15.8① 5.81±1.09①對照組 20 42.17±10.4 3.43±1.25 t值 6.27 3.95 P值 ﹤0.05 ﹤0.05

圖1 流感組IL-8與MDA的相關性:r=0.463，P=0.020

圖2 流感病毒表達強度與痰MDA的相關性:r=0.557，P﹤0.05

3 討論

越來越多的研究顯示，呼吸道病毒感染是引起AECOPD的重要因素。與沒有病毒參與的AECOPD相比，伴有病毒感染AECOPD患者的臨床癥狀評分更高，痰和血液中的炎性因子水平更高，中位恢復時間更長，發作頻率也更頻繁［1，5］。本研究系統探討了流感病毒對AECOPD患者氧化應激和氣道炎癥的影響。

作為COPD發病的重要病理生理機制，氧化/抗氧化失衡一直是COPD研究的重要方向［6］。MDA是氧化過程的終產物，具有強氧化性，可損害機體的組織和細胞，進而引起慢性疾病及衰老效應;而SOD能催化O-2發生歧化反應，以清除氧自由基，保護肺臟免受氧化損傷。二者可間接反應自由基代謝水平。本研究發現，和其他病因所致AECOPD一樣，流感病毒致AECOPD患者氣道內也存在氧化應激增強，表現為痰液MDA水平升高，而SOD明顯降低(P＜0.01)。而且流感病毒感染者MDA水平與流感病毒轉錄強度成正相關(r=0.557，P﹤0.05)，提示流感病毒復制在COPD患者氧化應激中發揮重要作用［7］。糾正氧化/抗氧化失衡可能成為對抗流感病毒誘發AECOPD的重要方法。Yamada等早期研究發現應用抗氧化劑可保護小鼠抵抗致死劑量流感病毒A的危害［8］。但限于藥物發展以及氧化/抗氧化平衡在機體的重要作用，尚無成熟的強效抗氧化劑應用于重癥流感病毒的臨床工作。進一步闡明流感病毒與氧化應激反應的內在聯系，以及抗氧化治療的機制是目前亟待解決的難題。最近研究發現抗氧化劑乙酰半胱胺酸能夠抑制Ⅱ型上皮細胞的粘蛋白合成和促炎介質釋放［9］。而Yageta等發現抗氧化因子Nrf2參與了吸煙小鼠對流感病毒感染的抵抗，再次證實氧化應激在流感病毒感染中發揮重要作用［10］。

IL-6和IL-8是兩種重要的COPD促炎性反應因子，具有活化中性粒細胞和淋巴細胞，促進免疫蛋白分泌，推進炎性反應過程發展的作用，除有助于殺傷病原微生物及控制感染，二者的持續升高還參與了氧化應激過程。IL-6能夠促進中性粒細胞的氧化反應，延緩中性粒細胞凋亡，釋放更多超氧陰離子，加重氧化應激反應。IL-8能夠吸引炎性細胞尤其是中性粒細胞到達炎性反應部位，并誘導其脫顆粒作用，釋放大量氧自由基、組胺、花生四烯酸等系列炎性癥介質，加重氣道氧化應激炎性反應。和以往研究一致，本研究流感組COPD患者血清IL-8和IL-6水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，且本研究發現，流感組血清IL-8水平與氣道MDA呈正相關(r=0.463，P=0.020)。這一結果進一步證明，在AECOPD氣道氧化應激和炎性反應的同時存在全身炎性反應增強［11］。

綜上所述，流感病毒感染與氧化應激間存在密切的聯系，對于COPD患者在流感早期應用抗氧化應激的藥物，可能緩解病情，改善患者預后，降低患者住院率和經濟負擔。有關闡明流感病毒參與氧化應激反應的機制，以及抗氧化治療的作用，尚需進一步研究和評價。

［1］ Varkey JB，Varkey B.Viral infections in patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］.Cur Opinion Pulm Med，2008，14(2):89.

［2］ Global Strategy for the Diagnosis，Management and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease(update2010).Available from:http://www.goldcopd.org/Guidelines/guideline-2010-gold-report.html.

［3］ 劉凌云，曾 勉，謝燦茂，等.慢性阻塞性肺病患者氧化應激狀態及其與糖皮質激素受體水平的相關性［J］.南方醫科大學學報，2008，28(6):992.

［4］ Rohde G，Wiethege A，Borg I，et al.Respiratory viruses in exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease requiring hospitalization:a case-control study［J］.Thorax，2003，58(1):37.

［5］ Gorse GJ，O'connor TZ，Young SL，et al.Impact of a winter respiratory virus season on patients with COPD and association with influenza vaccination［J］.Chest，2006，130(4):1109.

［6］ Inonu H，Doruk S，Sahin S，et al.Oxidative stress levels in exhaled breath condensate associated with COPD and smoking［J］.Respir Care，2012，57(3):413.

［7］ Yamada Y，Limmon GV，Zheng D，et al.Major shifts in the spatio-temporal distribution of lung antioxidant enzymes during influenza pneumonia［J］.Plos One，2012，7(2):e31494.

［8］ Yatmaz S，Seow HJ，Gualano RC，et al.Glutathione Peroxidase-1(GPx-1)reduces influenza A virus-induced lung inflammation，2012.

［9］ Mata M，Morcillo E，Gimeno C，et al.N-acetyl-L-cysteine(NAC)inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus(RSV)［J］.Biochem Pharmacol，2011，82(5):548.

［10］ Yageta Y，Ishii Y，Morishima Y，et al.Role of Nrf2 in host defense against influenza virus in cigarette smoke-exposed mice［J］.J Virol，2011，85(10):4679.

［11］ 國 家，丁 會，華樹成.慢性阻塞性肺疾病的治療進展［J］. 吉林醫學，2010，31(4):539.