2型糖尿病患者尿足細胞的排泄及其相關因素

馮秋霞 程麗靜 蘆露 羅蘭 白艷 李萍 季軍 高政南

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見并發癥之一，但其發病機制是復雜的，目前尚不完全清楚。近年研究發現，腎臟的足細胞損傷在糖尿病腎病的發病機制及預后均具有重要的作用。在各種致病因素作用下，足突細胞損傷可能的機制包括足突消失、足細胞肥大、脫落、凋亡，或上皮細胞-間充質細胞轉換，其中受損后脫落的足細胞可隨尿液排泄[1-3]。本研究觀察了2型糖尿病(T2DM)患者尿中足細胞數量的變化，研究其與血清C反應蛋白(CRP)的關系，以探討糖尿病腎病患者足細胞脫落的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 T2DM組:按照1999年WHO糖尿病診斷標準，收集我院2008～2010年門診和住院的124例T2DM患者(內生肌酐清除率＞90 ml/min)，除外合并糖尿病急性并發癥、大血管并發癥、妊娠、感染、應激、外傷、惡性腫瘤、其他可能的腎臟病，以及曾服用血管緊張素轉換酶抑制劑、他汀類降脂藥、噻唑烷二酮類藥物者，空腹血糖＜7.0 mmol/L，餐后2 h

血糖＜10.0 mmol/L，血壓＜140/90 mm Hg。所有患者根據尿白蛋白排泄率(UAER)分為正常蛋白尿組(UAER ＜20μg/min，NA組)38例，微量白蛋白尿組(UAER 20～200μg/min，MA組)59例，大量蛋白尿組(UAER ＞200μg/min，CP組)27例。25名健康體檢者作為正常對照組(NC組)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 小鼠抗人podocalyxin單克隆抗體，由美國密西根大學David B.Kershaw教授惠贈，FITC標記山羊抗小鼠抗體IgG購自北京中杉生物技術有限公司。

1.2.2 空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(P2HBG)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血肌酐(SCr)應用全自動生化儀進行檢測;糖化血紅蛋白(HbA1 c)測定采用金標法;UAER測定采用放免法;CRP檢測采用免疫比濁法。

1.2.3 尿中足細胞觀察及足細胞數量檢測采用間接免疫熒光法。主要步驟如下:取新鮮中段尿液100 ml，以1200 r/min離心5 min。棄上清，取80μL尿沉渣甩片，室溫干燥30 min。丙酮4℃固定10 min，自然干燥，以0.01PBS沖洗。置1%Triton-1005 min，羊血清蛋白封閉，室溫30 min。小鼠抗人Podocalyxin單克隆抗體體積比1:20稀釋，4℃過夜。FITC熒光標記山羊抗小鼠IgG體積比1:75稀釋，37℃孵育30 min。碘化丙啶染核，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光波長580 nm;每份標本低倍鏡觀察全片，高倍鏡下確認胞膜呈綠色、胞核為紅色的細胞為足細胞。由兩位作者同時觀察全片，記錄完整足細胞的個數，并根據稀釋倍數計算單位體積尿液的足細胞數。

1.3 統計學方法 所有數據應用SPSS14.0統計軟件進行分析，計數資料采用χ檢驗，計量資料采用t檢驗。

2 結果

2.1 對照組和糖尿病各組的年齡、性別分布、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、體重指數(BMI)、TC、TG、FPG、P2 hBG、HbA1c兩兩比較無明顯差別，見表1。

表1 各組的資料比較(±s)

表1 各組的資料比較(±s)

注:與 NC組比較，*P＜0.05，＊＊P＞0.05，;與 NA 組比較，△P＜0.05;與 MA 組比較，☆P＜0.05，◆P＜0.01。

25 38 59 27年齡(歲) 53.4±7.6 52.9±7.3 55.0±9.1 54.8±8.6性別(男/女) 11/14 20/18 28/31 14/13病程(年) 0 5.4±2.8 9.1±4.3△ 12.5±7.7☆SBP(mm Hg) 126.4±6.5 132.1±4.7 129.3±8.3 133.8±7.22 dBP(mm Hg) 79.5±8.7 76.3±10.1 80.5±6.9 82.4±9.4 BMI(kg/m2) 23.02±3.32 25.87±2.09 26.14±3.07 24.34±4.45 TC(mmol/L) 4.75±2.09 4.95±1.67 5.03±1.73 4.87±1.34 TG(mmol/L) 1.97±2.62 2.35±2.85 2.17±1.64 2.08±2.21 FPG(mmol/L) 4.85±0.93 5.16±1.32 5.39±0.68 5.64±1.07 P2hPG(mmol/L) 6.93±1.54 7.04±3.89 7.12±1.09 7.15±2.53 HbAl C(%) - 6.5±1.7 6.7±1.4 6.4±1.5 UAER(μg/min) 7.15±4.82 9.34±8.27* 83.52±42.93△ 437.69±214.73◆SCr(μmol/L) 53.51±9.23 51.79±8.43* 79.23±12.36△ 97.46±213.54☆CRP(mg/L) 1.03±1.22 2.34±1.67＊＊ 6.83±2.31△ 11.37±4.3☆足細胞數量(個/ml) 0.3±0.3 0.4±0.2＊＊ 2.4±0.9△ 6.3±2.5 NC NA MA CP例數(個)組別☆

2.2 與對照組相比，糖尿病正常蛋白尿組的血CRP、尿足細胞數量無明顯升高(P＞0.05)。而糖尿病微量白蛋白尿組與正常蛋白尿組患者比較，大量蛋白尿組與微量白蛋白尿組比較，病程、UAER、SCr、CRP、尿足細胞數量均顯著升高(P ＜0.05或P＜0.01)。

3 討論

診斷糖尿病腎病的金標準是腎活檢，但因為該方法具有創傷性而較少應用于日常臨床工作。UAER是目前臨床上評估糖尿病腎病最為常用的方法，但在合并感染、高蛋白飲食時容易受到干擾，無法真實地反映腎臟的病理改變。腎小球上皮細胞又稱足細胞，是腎小球濾過屏障的重要結構。在糖尿病腎病患者，足細胞會受到損傷而發生凋亡和脫落[4，5]，最終排泄到尿液中。Podocalyxin是僅表達于足細胞的一種膜蛋白，故成為足細胞的標志性蛋白。應用抗podocalyxin的單克隆抗體對尿沉渣進行免疫熒光染色，是一種檢測尿中足細胞的特異性方法[6]。Nakamura T[7]的研究表明，在伴有微量白蛋白尿和大量蛋白尿的DN患者尿中可檢測出足細胞，且后者尿中足細胞數量明顯多于前者。本研究通過間接免疫熒光染色方法，觀察了T2DM患者尿中足細胞及其排泄的變化，結果發現T2DM患者尿中足細胞數量隨UAER升高而增加，與Nakamura報道的結果一致。本研究還觀察到正常蛋白尿的DM患者也有少量的足細胞排泄，但與正常對照組無顯著性差異。國外曾有資料[8]表明足細胞的脫落可以早于尿蛋白的增加，與本研究的結果不同，可能與本研究的例數較少有關。由此可見，尿足細胞排泄較UAER可以更好地反映DN的病理改變，并與DN程度相關。本研究采用的尿足細胞檢測方法直接反映了腎臟的病理損害，而且具有無創傷性的特點，比UAER更加抗干擾，比腎活檢更易于臨床廣泛開展。

糖尿病腎病患者腎臟足細胞脫落的機制目前不十分清楚。2006年 Hotamisligil GS[9]首次提出了代謝性炎癥的概念，這種慢性低度、代謝引發的炎癥主要由營養物和代謝過剩所觸發。隨后尚有大量研究表明，炎癥在糖尿病腎病的發病機制中也扮演著重要的角色[10，11]，而炎癥因子CRP不僅是T2DM發病的強預測因子[12，13]，在DN患者也可見到CRP明顯升高[14，15]。本研究中 DM 患者的血 CRP水平不僅與UAER相關，也與其尿中足細胞的數量相關。這一結果提示DN患者足細胞的損傷及脫落可能與代謝性炎癥有關。已有研究發現CRP可引起局部炎癥，促進IL-6和黏附因子等的釋放，上調白細胞抗原表達，增加自由基和蛋白水解酶，最終導致腎小球結構和功能改變[16]。這些機制可能參與并導致了足細胞的脫落。

本研究證實了DN患者尿中足細胞排泄數量增多，其數量與腎病的程度有關，而且與炎癥因子CRP的變化一致。提示慢性炎癥反應可能是DN患者足細胞脫落的原因之一，但確切的機制尚需進一步研究。尿足細胞數量的測定有可能成為評估糖尿病腎病的新手段。

圖1 免疫熒光染色顯示尿中足細胞

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