西藏飛蝗蟲糞粗提物的成分分析及其活性測定

王海建，李彝利，李 慶，*，楊 剛，匡健康，蔣春先，楊群芳

(1.四川農業大學農學院，成都 611130;2.四川甘孜州農業局，康定 626000)

西藏飛蝗Locusta migratoria tibetensis(Chen)是青藏高原獨有的飛蝗亞種，分布在我國青海省南部、川西高原和西藏自治區，主要危害青稞、玉米、小麥等禾本科作物及牧草等。它與東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)、亞洲飛蝗Locusta migratoria migratoria(Linnaeus)一起被稱為我國的“三大飛蝗”［1］。近年來西藏飛蝗在西藏、川西高原和青海玉樹等地發生危害十分嚴重，且有蔓延的趨勢，給當地的農牧業帶來了嚴重的經濟損失［2］。自1963年陳永林訂立西藏飛蝗亞種以來［3］，我國對西藏飛蝗的研究主要集中在形態描述、生物學和生態學特性等方面［4-8］。如李慶等對西藏飛蝗生活史、抗寒性、產卵習性以及西藏飛蝗對溫度和紫外輻射的適應機制進行了研究［4-7］，楊群芳等對西藏飛蝗的食性進行了研究［8］。

由于西藏飛蝗主要滋生于偏遠民族地區，從高原藏族宗教文化和環境保護等方面考慮，單靠化學方法來防治西藏飛蝗可行性低，需要從生態治理等方面著手。利用信息化合物監測和防治廣泛分布的蝗蟲，是可持續蝗災治理的新理念［9-11］。西藏飛蝗危害嚴重的主要原因之一在于其群集性。昆蟲聚集信息素是由昆蟲產生，并且能夠引起同種昆蟲產生聚集行為反應的化學物質，在昆蟲群集中起著重要作用［12］。關于蝗蟲聚集信息素的研究報道多見于非洲飛蝗Locusta migratoria migratorioides(Reiche＆Fairmaire)［13］、沙漠蝗(Schistocerca gregaria(Forsk?l))［13-14］和東亞飛蝗［15］。現已證明聚集信息素對于蝗蟲的型變、群集起到主要的調節和控制作用。蝗蟲聚集信息素可存在于糞便、卵囊、蟲體及泡沫等部位［16-22］。不同種類蝗蟲聚集信息素組分和含量存在差異，同種蝗蟲不同發育階段、不同性別之間也存在差異。Torto等人證實沙漠蝗聚集信息素表現出明顯的階段性差異和性別差異，其體表分泌2種不同聚集信息素:一類由蝗蝻釋放只對蝗蝻作用，另一類由成蝗釋放且只對成蝗作用，且兩類信息素的成分不盡相同［18-19］。Njagi等研究表明散居型沙漠蝗聚集信息素中缺少群居型主要的苯乙腈，并且群居型雄成蟲聚集信息素在維持種群聚集及使散居型向群居型轉變過程中起著重要作用［20］。石旺鵬等［23-24］和郭志永等［25］研究表明東亞飛蝗聚集信息素主要存在于糞便中，其5齡蝗蝻與成蟲之間、雌雄成蟲之間的糞便揮發物化學組分基本相似，但是各成分的組成比例存在差異，而且包含多種電生理活性物質。Yu等［26］利用氣相色譜技術證實東亞飛蝗成蟲糞便揮發物中含有30多種化合物，并通過質譜分析結果和保留時間鑒定出9種能夠激起雄成蟲觸角電位反應的化合物。關于西藏飛蝗聚集信息素的研究國內外未見相關報道。本文采用自制Y型嗅覺儀、氣質聯用(GC-MS)和觸角電位反應(EAG)等方法對西藏飛蝗蟲糞粗提物進行了活性測定和成分分析，以期為進一步研究西藏飛蝗聚集機制及利用聚集信息素對西藏飛蝗進行生態治理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從四川甘孜州理塘縣采回西藏飛蝗低齡蝗蝻(群居型顏色為黑褐色至黑色，散居型為草綠色)，在實驗室用新鮮玉米葉(雅玉二號)飼養成生長情況一致的群居型和散居型蝗蟲供試。飼養條件為溫度(25±1)℃，相對濕度為60%—70%，光周期為12/12(L/D)。為了避免西藏飛蝗發生型變，將群居型和散居型蝗蝻分別放在不同房間的人工氣候箱中以25頭/籠和1頭/籠進行隔離飼養，以獲得群居型和散居型蝗蟲。同時，每天收集蝗蟲糞便，直到成蟲20d。將每天收集到的糞便清除干凈雜質并用鋁箔紙包好，放入－20℃冰箱。供試前將每一齡期糞便5g/包混在一起。文中低齡蝗蝻指1—2齡蝗蝻，高齡蝗蝻指3—5齡蝗蝻。

1.2 試驗方法

1.2.1 西藏飛蝗蟲糞粗提物的制備

溶劑直接浸提法取充分研磨的西藏飛蝗糞便5g置于100mL錐形瓶，加入50mL乙醇充分振蕩，1h后過濾得粗提物，將粗提物置于冰浴中經N2濃縮后，置于－20℃冰箱保存待測。丙酮和二氯甲烷提取采用乙醇相同的方法，正己烷浸提需在65℃水浴中加熱。

超聲波提取法取充分研磨的西藏飛蝗糞便5g置于100mL錐形瓶，加入50mL乙醇，用超聲波細胞粉碎機處理1h后，過濾得粗提物，將粗提物置于冰浴中經N2濃縮后，置于－20℃冰箱保存待測。

1.2.2 西藏飛蝗對其蟲糞粗提物的行為反應

采用自制Y型嗅覺儀進行行為反應測定。Y型嗅覺儀主管長50cm，兩側臂分別長30cm，內徑7cm，兩臂夾角為75°，Y型嗅覺儀兩側臂分別通過Teflon管與樣品室連接，一個樣品室內放入充分浸潤西藏飛蝗蟲糞粗提物的脫脂棉球，另一個樣品室中放入充分浸潤同體積提取溶劑的脫脂棉球作對照;采用大氣采集儀抽氣，使每側臂氣流速度均控制在250mL/min。從Y型嗅覺儀主管末端接入西藏飛蝗試蟲1頭，每次觀察3min。如果試蟲釋放后在某一側臂的前臂(即側臂與氣味源連接處的1/2處)活動時間持續超過1min，就記為試蟲對該側臂所連接的氣源有趨向性;如果試蟲釋放后，在整個3min觀察時間內，在任一側臂的前臂均未持續活動超過1min，就記為該試蟲在整個試驗中對氣源無趨向性。

行為反應測定在溫度(25±1)℃的室內進行。每處理試蟲10頭，重復3次。每測試2頭試蟲時調換一下Y型管兩側臂的方向，以消除幾何位置對試蟲行為可能產生的影響。每處理測試完后，用75%的酒精清洗嗅覺儀，吹風機吹干，靜置30min后再測定。

1.2.3 西藏飛蝗蟲糞粗提物成分分析

利用氣相色譜-質譜聯用儀分析西藏飛蝗不同類型、性別、齡期糞便粗提物的成分。氣相色譜條件:HP-5MS石英毛細管柱(30cm×0.25mm×25μm)，無分流進樣;載氣:氦氣(He);壓力:20kPa。具體的升溫程序:初始溫度為60℃，保留3min;然后以4℃/min升溫至80℃，保留3min;再以20℃/min升溫至180℃，保留1min;最后以4℃/min升溫至220℃，保留5min。進樣口溫度為250℃，GC-MS接口溫度為270℃，進樣量2μL。質譜條件:EI離子源，離子源溫度150℃，四極桿溫度230℃，電離能為70 eV，掃描范圍(m/z)35—550amu，載氣流速:1mL/min。用WILEY軟件進行數據采集和分析，2min后開始采集數據，所得質譜圖直接與WILEY數據庫檢出的標準圖譜進行對照，并通過查閱相關資料以確定其化學組分。

1.2.4 西藏飛蝗對人工合成化合物觸角電位反應

試驗時將西藏飛蝗觸角沿基部切下，并將觸角頂部切下2—3mm，然后將基部置于參考電極，端部置于記錄電極上。取一定量的化合物滴于2cm×0.5cm的濾紙片上，并置于1000μL移液槍頭中。設定純化空氣流速為100mL/min，樣品刺激時間為300ms，兩次刺激間的時間間隔為2min。試驗所用觸角電位儀由荷蘭Syntech公司生產，測定所需軟件也由該公司提供。

每處理測試觸角5根，每根刺激5次。為消除觸角適應所導致的偏差，測試前后均使用乙醇做空白對照，將每一樣品測定值的平均數除以前后2次對照測定值的平均值即得EAG凈反應值。

1.2.4 數據處理

應用SPSS17.0數據處理系統對數據進行方差分析和Duncan氏新復極差測驗。

2 結果與分析

2.1 西藏飛蝗蟲糞粗提物提取方法比較

西藏飛蝗散居型和群居型4齡蝗蝻對不同方法提取的蟲糞粗提物的趨向率存在差異(圖1，圖2)。除群居型4齡蝗蝻對群居型高齡蝗蝻蟲糞粗提物外，散居型和群居型4齡蝗蝻對不同來源蟲糞粗提物的趨向率均表現為乙醇浸提法＞丙酮浸提法＞二氯甲烷浸提法＞正己烷浸提法＞乙醇超聲波提取法。乙醇浸提法提取的蟲糞粗提物活性顯著高于正己烷浸提法和乙醇超聲波提取法。群居型4齡蝗蝻對群居型高齡蝗蝻乙醇超聲波提取法的蟲糞粗提物趨向率略高于正己烷浸提法，但兩者之間無顯著差異。因此，在五種方法中乙醇浸提法是提取西藏飛蝗蟲糞粗提物的最佳方法，后續試驗中蟲糞粗提物均用該方法得到。

圖1 西藏飛蝗散居型4齡蝗蝻對不同蟲糞粗提物的趨向率Fig.1 The taxis ratio of solitary 4th instars L.migratoria tibitensis Chen to different fecal extract

圖2 西藏飛蝗群居型4齡蝗蝻對不同蟲糞粗提物的趨向率Fig.2 The taxis ratio of gregarious 4th instars L.migratoria tibitensis Chen to different fecal extract

2.2 西藏飛蝗對不同蟲糞粗提物的行為反應

西藏飛蝗對其蟲糞粗提物均有一定趨向性，但對不同蟲態的蟲糞粗提物趨向性存在顯著差異(表1)。其中，群居型雄成蟲對其自身蟲糞粗提物趨向率最高為76.67%，而群居型4齡蝗蝻對群居型低齡蝗蝻的蟲糞粗提物趨向率最低，僅為36.67%。

西藏飛蝗各蟲態對群居型成蟲蟲糞粗提物的趨向性明顯高于對其他蟲態蟲糞粗提物的趨向性;且對群居型雄成蟲蟲糞粗提物的趨向性略高于群居性雌成蟲，但對兩者并無顯著差異。各蟲態對群居型高齡蝗蝻蟲糞粗提物的趨向性略高于低齡，但對兩者并無顯著差異。說明群居型西藏飛蝗蟲糞粗提物活性隨蟲齡增加而增強。西藏飛蝗對散居型高齡蝗蝻的趨向性略高于低齡，對雄成蟲的趨向性略高于雌成蟲，但西藏飛蝗對散居型各蟲態蟲糞粗提物的趨向性之間無顯著性差異。

各蟲態西藏飛蝗對低齡蝗蝻蟲糞粗提物的趨向性均較低，都小于或等于50%;對成蟲蟲糞粗提物的趨向性無顯著性差異。散居型蝗蟲對蝗蝻蟲糞粗提物的趨向性高于同蟲態群居型蝗蟲對蝗蝻蟲糞粗提物的趨向性。除對散居型雄成蟲蟲糞粗提物外，雄成蟲對同一蟲糞粗提物的趨向性均高于雌成蟲。

表1 西藏飛蝗對不同蟲糞粗提物的趨向率(%)Table1 The taxis ratio of L.migratoria tibitensis Chen to different fecal extract(%)

2.3 西藏飛蝗不同蟲態蟲糞粗提物的成分分析

通過氣質聯用分析可知，不同蟲態西藏飛蝗蟲糞粗提物共含有35種化合物，主要包含烯烴、醇、醛、酮和酚類等(表2)。不同蟲態蟲糞粗提物所含化合物數量及含量有所差別。雌性成蝗化合物種類最多，散居型蝗蝻化合物種類最少。從各化合物含量看，西藏飛蝗蟲糞粗提物主要成份為環己醇、2，5-二甲基吡嗪、2，6，6-三甲基環己烯-1，4-二酮、壬醛、苯甲醛、(E)-3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇、3-苯基丁-2-醇和 2，2'-亞甲基雙-(4-6-叔丁基苯酚)。另外，蝗蝻蟲糞粗提物中(3β，5α)-2-亞甲基-3-膽甾烷醇含量遠高于成蝗。

2.4 西藏飛蝗對人工合成化合物的觸角電位反應

對西藏飛蝗蟲糞粗提物中含量較高的化合物及與東亞飛蝗聚集信息素相同的化合物進行觸角電位反應，結果見圖3。在0.04—4μL/mL濃度范圍內，除對(E)-3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇觸角電位反應不明顯外，西藏飛蝗試蟲對供試的人工合成化合物均有一定的電生理反應，其變化趨勢大致可分為3類。第一類是苯甲醛、2，6，6-三甲基環己烯-1，4-二酮、4-(2，6，6-三甲基環己烯基)3-丁烯-2-酮、2，5-二甲基吡嗪和己醛。西藏飛蝗各蟲態對濃度為2μL/mL和4μL/mL的各化合物觸角電位反應值均高于對照，且對濃度為2μL/mL的各化合物觸角電位反應值均最高。第二類是2-己烯醛、環己醇、庚醛、苯甲醇、壬醛和癸醛等6種物質。在0.04—4μL/mL濃度范圍，不同蟲態西藏飛蝗對同一化合物的電生理反應變化趨勢不一致。如散居型雌性成蟲和散居型雄成蟲對環己醇的電生理反應值隨環己醇濃度增大而增強;但散居型和群居性蝗蝻對濃度為4μL/mL的環己醇電生理反應值低于2μL/mL。第三類是2，2'-亞甲基雙-(4-6-叔丁基苯酚)、3-苯基丁-2-醇和1-乙基-3-甲基環戊烯。西藏飛蝗各蟲態對這3種化合物的電生理反應均顯著高于對照，且隨物質濃度增加，電生理反應值顯著增加。就不同蟲態西藏飛蝗對同一物質的反應值來看，總體呈現出散居型強于群居性、成蟲強于若蟲，雄性強于雌性的趨勢。

3 討論

本文表明溶劑浸提法獲得的粗提物活性隨提取溶劑極性增強而增強，乙醇浸提法獲得的粗提物活性最強，丙酮次之。說明西藏飛蝗蟲糞粗提物組分主要為高極性和中極性的物質，低極性的物質較少。超聲波提取法在處理糞便的過程中由于溫度上升或震動破壞了活性成分，故制備效果不理想。這與石旺鵬等的對東亞飛蝗糞便聚集信息素提取方法的研究結果報道一致［24］。

表2 GC-MS法鑒定的西藏飛蝗蟲糞粗提物成分及相對含量Table2 Chemical compounds and relative content in fecal volatile of L.migratoria tibitensis Chen identified by GC-MS

西藏飛蝗對不同蟲糞粗提物的行為反應表明，西藏飛蝗蟲糞粗提物活性隨蟲齡增加，群居型成蟲蟲糞粗提物活性最強，雄成蟲蟲糞粗提物活性高于雌成蟲，推測成蟲蟲糞粗提物可能在維持種群聚集中起主要作用。本試驗還發現散居型蝗蟲對蝗蝻蟲糞粗提物的趨向性高于群居型蝗蟲對蝗蝻蟲糞粗提物的趨向性。不同蟲態西藏飛蝗對同一人工合成化合物的觸角電位反應也總體呈現散居型強于群居型、成蟲強于蝗蝻，雄性強于雌性的趨勢。一方面可能是由于散居型西藏飛蝗觸角上感受器數量較群居型更多，對寄主植物、產卵場所等的感知和定位能力更強［27］;另一方面群居型蝗蟲群集生活，對生活環境中的類似信息素存在一定的適應性，因而對聚集信息素的敏感性不及散居型蝗蟲。

圖3 西藏飛蝗對不同濃度人工合成聚集信息素單質的觸角電位反應Fig.3 Electrophysiological responses of L.migratoria tibitensis Chen to different concentrations of synthetic active substance

現有關于沙漠蝗、非洲飛蝗和東亞飛蝗聚集信息素成分研究表明蝗蟲聚集信息素成份較為復雜。不同種類、同種不同生物型、不同性別、不同發育階段聚集信息素成分及作用對象均表現出明顯的差異［18-19，28］。西藏飛蝗成蟲較蝗蝻蟲糞粗提物中的化合物種類更多，表明隨蟲齡增長化合物種類增加。雌性可能由于生殖等原因，蟲糞粗提物化學組分最多，具體是何原因還有待進一步深入研究。群居型和散居型成蟲、蝗蝻蟲糞粗提物中均有11種物質與東亞飛蝗聚集信息素一致，依次為己醛、2-己烯醛、環己醇、庚醛、2，5-二甲基吡嗪、苯甲醇、苯甲醛、壬醛、癸醛、2，6，6-三甲基環己烯-1，4-二酮和 4-(2，6，6-三甲基環己烯基)3-丁烯-2-酮，但是比例有所不同。西藏飛蝗蟲糞粗提物中有些物質未曾在東亞飛蝗糞便揮發物中發現，如(E)-3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇、3-苯基丁-2-醇、1-乙基-3-甲基環戊烯和2，2'-亞甲基雙-(4-6-叔丁基苯酚)等。西藏飛蝗蟲糞粗提物中未發現愈創木酚、鄰二甲氧基苯和苯酚這3種沙漠蝗和非洲飛蝗聚集信息素中存在的化合物。這可能與西藏飛蝗和東亞飛蝗、非洲飛蝗等隸屬不同亞種，且食物、生活條件不同有關。另外，本研究采用溶劑浸提法獲得的蟲糞粗提物中既含有揮發性成分，也具有非揮發性成分，這也是引起西藏飛蝗和其他飛蝗化合物不同的主要原因。因此，在后續研究中，需直接提取蟲糞取揮發性成分做進一步研究。觸角電位反應說明，雖然在西藏飛蝗各蟲態糞便聚集信息素中(E)-3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇含量較高，但并無電生理活性。其余物質根據西藏飛蝗不同蟲態對不同濃度的反應趨勢大體可分為3類，說明不同活性成分作用濃度不同。各化合物最適濃度及不同化合物混合作用時，達到最大聚集活性的各成分比例，各成分含量還需進一步研究。在試驗中還發現，蝗蝻蟲糞粗提物中(3β，5α)-2-亞甲基-3-膽甾烷醇含量遠高于成蝗，由于未購得該成分人工合成化合物，并未對該化合物進行觸角電位反應，該化合物含量在成若蝗中顯著不同是否是引起成蝗和蝗蝻蟲糞粗提物活性差異的主要原因還需進一步研究。

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