E3泛素連接酶HECTD3真核表達質粒的構建

盧敏瑩 楊波

·實驗研究·

E3泛素連接酶HECTD3真核表達質粒的構建

盧敏瑩 楊波

目的 克隆E3泛素連接酶 (homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3, HECTD3) 基因及構建真核表達質粒。方法 提取人卵巢癌細胞SKOV-3細胞RNA, 并逆轉錄為cDNA, 以此作為模板PCR法擴增HECTD3基因, 將其克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+), 測序驗證構建質粒中包含HECTD3基因。結論 HECTD3基因克隆及真核表達質粒構建成功, 可以用于后續卵巢癌發生發展的分子生物學研究。

E3泛素連接酶；卵巢癌；真核表達質粒

泛素化是一種蛋白質的翻譯后修飾, 參與調控多種生物學過程, 其系統功能的紊亂與癌癥發展進程密切相關［1］。HECTD3 (homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3)是一個功能目前尚未闡述清楚的新的E3泛素連接酶。有報道指出該基因可能在乳腺癌和宮頸癌中介導順鉑的化療耐受［2］, 但是目前尚未有人報道HECTD3在卵巢癌中的作用。且卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤, 僅2011年1年就導致全世界140000人死亡［3］。因此本文擬克隆HECTD3基因, 并構建該基因真核表達質粒,對進一步研究HECTD3基因在卵巢癌發生發展中的作用提供有力的工具和手段。

1 實驗材料

卵巢癌細胞SKOV-3、真核表達載體pCDNA3.1、大腸桿菌DH5α感受態由本室保存。RPMI-1640、胎牛血清、胰酶購自美國Gibco公司。PrimeSTARHS DNA Polimerase with GC Buffer、EcoR I和Nhe I限制性外切酶購自TaKaRa公司。Gel Extraction Kit購自omega公司, DL2000、1Kb DNA Marker購自天根生化科技有限公司。引物由invitrogen公司合成, 測序也由該公司完成。其余試劑購自廣州威佳生物有限公司。

2 試驗方法

2.1 HECTD3基因的擴增 采用Trizol法提取SKOV-3細胞RNA, 并逆轉錄成cDNA。以該cDNA為模板進行HECTD3基因的擴增, Forward Primer： 5’-GGCgctagcATGGCGGGTCCTGGCCCGG-3’, Reverse Primer：5’-GGCgaattcTCACTCCTCC CAAGGGCTCATGTCA-3’, 其中小寫黑體的序列表示酶切位點。PCR結果用1%瓊脂糖凝膠檢測。將擴增的目的條帶用膠回收試劑盒回收, 具體操作見說明書。

2.2 pcDNA-HECTD3重組質粒的構建 利用限制性內切酶NheI和EcoRI, 37℃ 2 h消化真核表達載體pcDNA3.1(+)和PCR擴增得到的HECTD3基因片段, 回收載體和基因片段的酶切產物。T4 DNA Ligase 于16℃連接載體和基因片段。連接過夜后, 將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞,挑取單克隆送invitrogen公司測序。

3 結果

成功構建HECTD3真核表達質粒

從NCBI上得到HECTD3基因序列(gene bank number: NM_024602.5), 該基因開放閱讀框(open reading frame, ORF)全長是2586 bp, 編碼861 aa。由圖1.A可以看出PCR反應組在2500 bp左右有一條目標條帶, 割膠回收該條帶, 將回收后的PCR條帶和pcDNA3.1(+) 載體用限制性酶消化, 圖1.B即為消化后的pcDNA3.1(+) 載體, 該載體分子量大小為5428 bp。線性化的pcDNA3.1(+) 分子量大小與預期相符, 證明酶切反應成功。將酶切之后的載體和目的基因片段回收純化, 連接, 并轉化感受態細胞DH5α, 挑取單克隆5個, 送至invitrogen公司測序鑒定陽性克隆。陽性克隆序列在NCBI上比對序列(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), 將成功構建的HECTD3基因真核表達質粒命名為pcDNA-HECTD3。

(A)HECTD3基因的擴增：泳道1是PCR擴增反應組；泳道2是陰性對照組, 以雙蒸水代替cDNA模板；泳道3是天根DL2000 Marker；泳道4是天根1 Kb DNA Marker。(B) NheI和EcoRI 限制性外切酶37℃消化載體pcDNA3.1(+) 2h, 1%瓊脂糖 凝膠檢測酶切效果：泳道1是天根1 Kb DNA Marker, 泳道2是線性化的pcDNA3.1(+)載體。

圖1 pcDNA-HECTD3真核表達質粒的構建

4 討論

HECTD3基因是Yu J等人通過酵母雙雜交技術發現的一個新的E3泛素連接酶。他們發現HECTD3能夠在體內外與Tara形成復合物, 通過調節泛素化和降解Tara來參與細胞進程［4］。HECTD3基因C端有一個高度保守的HECT domain, N端有一個功能部分受損的DOC domain, 該domain主要是用于底物特異性識別的［5,6］。也有學者通過免疫共沉淀技術發現HECTD3能夠與Syntaxin 8形成復合物, 過表達HECTD3將會促進Syntaxin 8的泛素化, 說明HECTD3可能參與了神經元的發育［7］。由于HECTD3基因ORF涉及較多的高GC含量序列, 擴增該基因存在一定的難度。本研究采用高GC PCR buffer順利得到HECTD3基因片段并成功構建該基因的真核表達質粒。在后續的研究中, 我們將在mRNA水平和蛋白水平檢測該基因的表達情況, 同時構建該基因穩定表達的SKOV-3細胞系, 以期深入探討體外過表達該基因所引起的一些列細胞學變化及其具體的分子機制。

［1］ Chen C, Seth A K, Aplin A E.Genetic and expression aberrations of e3 ubiquitin ligases in human breast cancer.Mol Cancer Res, 2006, 4(10): 695-707.

［2］ Li Y,Chen X,Wang Z,et al.The HECTD3 E3 ubiquitin ligase suppresses cisplatin-induced apoptosis via stabilizing MALT1.Neoplasia, 2013, 15(1): 39-48.

［3］ Jemal A,Bray F,Center M M,et al.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

［4］ Yu J,Lan J,Zhu Y,et al.The E3 ubiquitin ligase HECTD3 regulates ubiquitination and degradation of Tara.Biochem Biophys Res Commun, 2008,367 (4): 805-812.

［5］ Pál M,Varga K,Nagy O,et al.Characterization of the Apc10/ Doc1 subunit of the anaphase promoting complex in Drosophila melanogaster.Acta Biol Hung, 2007, 58: 51-64.

［6］ Kaustov L,Lukin J,Lemak A,et al.The conserved CPH domains of Cul7 and PARC are protein-protein interaction modules that bind the tetramerization domain of p53.J Biol Chem, 2007, 282(15): 11300-11307.

［7］ Zhang L,Kang L,Bond W,et al.Interaction between syntaxin 8 and HECTd3, a HECT domain ligase.Cell Mol Neurobiol, 2009, 29 (1): 115-121.

Construction of eukaryotic expression plasmid containing HETCD3 gene

LU Min-ying, YANG Bo, HE Zhi-min Cancer Research Center, Affiliated Tumor Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510095,China

Objective To clone the gene of homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3 (HECTD3) and construct the HECTD3 gene expression plasmid.Methods The HECTD3 gene was cloned from ovarian cell cDNA by PCR and recombined into the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+).Results the HECTD3 gene was confirmed in the eukaryotic expression plasmid by sequence analysis.ConclusionThe HECTD3 gene expression plasmid can be the tools for further research of ovarian cancer.

Homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain Containing 3(HETCD3); Ovarian cancer; Eukaryotic expression plasmid

510095 廣州醫科大學附屬腫瘤醫院腫瘤研究所