大鼠腦缺血再灌注對白質的損傷作用

鄭曉燕 張良成 周琳瑛 高美欽 郭永正

·實驗研究·

大鼠腦缺血再灌注對白質的損傷作用

鄭曉燕 張良成 周琳瑛 高美欽 郭永正

目的 觀察和評價大鼠腦缺血再灌注誘發白質少突膠質細胞和髓鞘的損傷變化。方法按照隨機原則將實驗動物隨機分為假手術組(10只), 再灌注3 d組(15只)。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion reperfusion, MCAO/R)模型, 應用免疫組織化學染色檢測髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)的表達與分布；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的d-UTP切口末端標記技術(TdT2-ediated d-UTP nickend labeling technique, TUNEL法)檢測凋亡細胞。結果 腦缺血再灌注后, 動物均表現為神經行為功能障礙；與假手術組相比, 患側腦白質MBP陽性分布減少, 可見多量凋亡細胞。 結論 腦缺血再灌注可對腦白質造成顯著損傷, 表現為少突膠質細胞的凋亡, 以及髓鞘的損傷。

腦缺血；再灌注損傷；少突膠質細胞；髓鞘；髓鞘堿性蛋白

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦病中危及生命的重要病理過程。近年來, 隨著分子生物學和影響技術的發展, 腦白質缺血性損傷這種常見的臨床現象逐漸受到人們的重視。腦白質的損傷可破壞神經元之間、皮質和皮質下中樞之間的型號傳遞, 也可造成其神經纖維投射區的灰質損傷, 是急性缺血性腦損傷后部分神經功能恢復緩慢或難以恢復的原因之一［1,2］。有髓鞘的神經纖維是腦白質的重要組成部分, 髓鞘正常結構的維持對軸突快速電傳導、神經元之間的聯絡等功能起重要作用。本文重點觀察腦缺血再灌注損傷后腦白質少突膠質細胞及神經纖維髓鞘的變化, 目前國內有關這方面的報道較少。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠25只, 體重(250±20) g由上海實驗動物中心提供［SCXK(滬) 2007-0005］。

1.2 主要試劑和材料 羊抗大鼠MBP抗體(購于美國Santa Cruz公司), Tunel試劑盒(購于德國Roche分子生物化學制品公司), SP試劑盒(購于福州邁新公司), 3,3-二氨基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯示劑(購于福州邁新公司), 尼龍線栓(購于北京沙東生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的制備及分組 按照隨機原則將實驗動物隨機分為假手術組(10只)、再灌注3 d組(15只)。假手術組除不插入線栓外, 其余操作同再灌注組。再灌注組大鼠采用線栓法建立MCAO/R模型。

1.3.2 神經功能學評分 參考Longa的5級4分標準進行神經功能學評分。1~4分為有效模型。

1.3.3 組織切片制備 假手術組、再灌注組各取10只, 深度麻醉后快速斷頭取腦, 取自視交叉平面后的厚約2 mm冠狀切片, 制成5 μm厚度的切片, 貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上, 分別用于免疫組化染色和凋亡細胞原位檢測。

1.3.4 免疫組化染色 取上述切片常規脫蠟水化, 3%過氧化氫去除內源性過氧化物, 正常雞蛋清封閉, 滴加一抗, 37 ℃濕盒過午, 滴加二抗, 室溫作用20 min, 滴加酶標記體, DAB顯色, 蘇木素復染, 中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.3.5 凋亡細胞原位檢測 取上述切片常規脫蠟水化, 經雙蒸水沖洗后, 按照Tunel試劑盒說明操作, DAB顯色, 蘇木素復染, 中性樹膠封片后光鏡下觀察。

2 結果

2.1 神經行為功能評分 假手術組10只大鼠術后均存活,除部分出現Horner征外, 未見神經行為功能異常。再灌注3 d組15只大鼠術后存活12只, 其中Longa評分1分的有3只, 2分的5只, 3分的4只, 均為有效模型。死亡的3只大鼠,尸體解剖可見大腦蛛網膜下腔出血或腦組織高度水腫, 提示其死因為顱內血管破裂或高顱內壓。

2.2 MBP免疫組織化學改變 假手術組大鼠腦白質可見MBP陽性分布, 陽性信號較強, 常成簇分布, 左右大腦半球對稱分布。再灌注3 d組健側大鼠腦MBP陽性信號與假手術組相同(圖1.A), 患側MBP染色彌散, 陽性反應少于假手術組, MBP表達稀疏(圖1.B)。

2.3 凋亡細胞原位檢測 光鏡下, 凋亡細胞的胞核被標記上棕黃色, 正常細胞的胞核為藍色。假手術組和再灌注3 d組健側腦白質沒有觀察到凋亡細胞(圖2A), 患側大腦白質可見多量凋亡的細胞(圖2.B)。

HE染色, ×40。右上為局部放大圖, 再灌注3 d組右側腦白質浸潤的炎癥細胞(→), HE染色, ×200。TEM×8000。TEM×10000。

3 討論

有髓鞘包裹的神經纖維是大腦白質的重要組成部分。在中樞神經系統髓鞘由少突膠質細胞延伸的胞質膜所構成, 這些細胞由胞質膜發出“帆樣”突起, 每一個突起構成髓鞘的一個結間段, 突起呈螺旋狀纏繞軸突, 形成同心圓狀板層。本實驗應用Tunel法發現缺血再灌注后患側腦白質有多量凋亡細胞。這與缺血再灌注后肝細胞的損傷變化一致［3］。目前缺血再灌注后少突膠質細胞發生這些病理變化的原因還未闡明, 作者考慮與以下幾個因素有關。由于少突膠質細胞缺乏補體抑制蛋白, 容易受到炎癥因子的攻擊。腦缺血再灌注后,腦組織內IL-1, IL-6 和TNFα等促炎因子表達增多［4］。因此作者認為少突膠質細胞發生這些病理變化可能與MCAO/ R后這些促炎因子過度表達有關。此外, 髓鞘和少突膠質細胞表達NMDA和非NMDA型谷氨酸受體(后者包括AMPA受體和紅藻氨酸受體), 其過度興奮可導致髓鞘和少突膠質細胞變性［5］。有學者認為氧自由基以及細胞內細胞內Ca2+超載, 產生Ca2+依賴性細胞損傷也與腦缺血再灌注后白質損傷有關［6］。

MBP是髓鞘相關蛋白的主要成分, 由成熟的少突膠質細胞合成, 集中分布于有髓纖維束, 對髓鞘正常結構的形成及維持起重要作用。MBP合成不足的小鼠可出現軸突嚴重低髓鞘化, 已髓鞘化的軸突其髓鞘同心圓狀板層結構松弛, 喪失正常的致密結構［7］。缺血損傷后少突膠質細胞的髓磷脂相關基因表達受到持久抑制, 即使細胞始終存活, 髓鞘合成亦會逐漸減少。汪長勝等［8］認為由于髓磷脂分解和破壞具有較長的半衰期(2.5~8.7 d), 髓鞘損傷多發生在缺血后10~14 d。而本實驗中, MCAO 2 h后再灌注3 d組的大鼠, 患側腦白質廣泛性MBP染色彌散, 局部可見MBP染色缺失, 與Tanaka K等［9］觀察結果相似。這差異可能與缺血程度、缺血時間、及再灌注損傷有關。

髓鞘的破壞作者認為至少有兩方面的原因, 一方面由于中樞神經系統髓鞘是由少突膠質細胞膜盤繞而成的, 因此少突膠質細胞的病變必然引起髓鞘合成減少或脫髓鞘改變。另一方面軸索的破壞也是引起髓鞘病變的一個重要原因。目前軸索破壞的相關機制還未完全闡明, 作者認為雖然軸突缺乏興奮性氨基酸受體, 但非突觸的細胞機制亦可介導缺血再灌注損傷, 損傷的軸突釋放大量興奮性氨基酸, 通過受體機制可加重少突膠質細胞的損傷。作者將在后續的實驗中繼續研究。

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350001 福建醫科大學附屬協和醫院麻醉科(鄭曉燕 張良成 郭永正)；福建醫科大學病理學系(周琳瑛 高美欽)

張良成