實時熒光P C R在人乳頭瘤病毒臨床檢測中的應用

胥 文

山東省萊蕪鋼鐵集團有限公司醫院檢驗科，山東萊蕪 271126

大量的臨床研究報道證實人乳頭瘤病毒（HPV）是導致女性宮頸癌和癌前病變的主要病毒，調查顯示宮頸癌患者的標本HPV檢出率已經超過了90%，因此做好人乳頭瘤病毒的檢查診斷對宮頸疾病的預防和治療有著極其重要的臨床價值[1]。國際癌癥組織對世界多個國家地區的宮頸癌進行了調查研究，發現該類病毒主要有15種高危型DNA，HPV16、HPV18和HPV58是我國最為常見的三種高危型病毒[2]。目前第二代雜交捕獲法是檢測HPV的主要方法，隨著生物技術的進步發展，實時熒光PCR技術的出現為DNA的臨床檢測提供了簡便和快捷。本次研究主要對第二代雜交捕獲法和實時熒光PCR的檢測結果進行了比較分析，以期為臨床診斷HPV提供參考，現總結如下：

1 資料與方法

1.1 研究對象

隨機選取2010年10月～2011年10月于本院婦產科接受診治的人乳頭瘤病毒感染患者102例，年齡24～60歲，平均（34.8±2.6）歲；臨床細胞檢查結果：低度鱗狀上皮細胞內病變患者40例，高度鱗狀上皮內病變患者16例，不典型鱗狀細胞46例；所有患者均無其他嚴重的生殖系統疾病，本次檢查已征得患者的同意。

1.2 試劑和儀器

本次試驗所用的主要試劑盒器材如下：美國Digene公司提供HPV-DNA試劑盒、HCⅡ基因雜交信號擴大系、子宮頸采樣器，Xygen公司提供的微孔板封面膠膜和圓底96孔酶標板；上海復星診斷公司提供的高危型HPV實時熒光PCR試劑盒和實時熒光PCR儀（Line-Gene FQIN33 A型）。

1.3 試驗方法

采取對照性試驗進行分析探討，分別使用第二代雜交捕獲法（HCⅡ）和實時熒光PCR對102例患者的標本進行檢測，結合患者的病理資料對兩種檢測方法的結果進行比較分析。

1.4 檢測方法

1.4.1 第二代雜交捕獲檢測 本方法可對13種高危型HPV進行同步檢測，根據試劑盒說明書進行相應的試驗操作，首先是對標本DNA解鏈，將解鏈后的單鏈DNA與RNA探針雜交，得到DNA-RNA的雜交體，雜交體可同微孔壁特異性抗體進行結合，磷酸化抗體后信號放大，底物經堿性磷酸酶作用后發光，通過發光的強弱來對微孔壁上磷酸酶含量進行測定，最后獲得特異性結合雜交體含量。如果HPV負荷量超過1.0 pg/mL則可判定為發生 HPV陽性感染。

1.4.2 實時熒光PCR檢測 不同探針和引物（3'端和5'端分別標有熒光淬滅基團和熒光報告基團）需要在特異性堿基區和模板作用，Taq酶能夠將探針降解，此時熒光報告基團可以擺脫熒光淬滅基團，增強熒光信號，通過定量PCR儀動態檢測標本熒光信號，確定其型別。實時熒光PCR劑盒也可對13種高危型HPV型進行檢測，其操作流程主要根據試劑盒說明書實施，大概步驟：樣本DNA的提取-實時熒光PCR反應液的配置-樣本實時熒光PCR擴增和檢測-根據熒光值判定反應結。

1.5 統計學方法

所得數據采用SPSS 12.0統計軟件進行分析處理，計量資料用±s表示，采用t檢驗或χ2檢驗對相關數據進行比較分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同程度宮頸病變的HPV陽性檢出率

病理資料顯示本組病例中宮頸上皮內瘤變（CIN）的有38例，慢性宮頸炎和鱗狀上皮病變的36例，HCⅡ和實時熒光PCR對CIN的HPV陽性檢出率分別為86.84%和94.74%，對慢性宮頸炎和鱗狀上皮病變的陽性檢出率分別為36.11%和58.33%，具體比較情況見表1。

表1 兩種方法不同程度宮頸病變的HPV陽性檢出率比較[n（%）]

2.2 HPV的陽性檢出率和符合率

HCⅡ的HPV總陽性檢出率為62.75%，實時熒光PCR的為71.57%，兩組比較差異具有統計學意義（χ2=3.46，P＜0.05），兩種方法的總符合率為82.35%，具體比較情況見表2。

表2 兩種方法的陽性檢出率比較

2.3 CIN的臨床檢測

根據患者的病理檢查結果對CINⅡ和CINⅢ的檢測結果進行比對發現兩種手段在高危型宮頸病變的檢測具有較好的相關性，實時熒光PCR的靈敏性和特異性要略好于HCⅡ。

3 討論

3.1 人乳頭瘤病毒

目前的臨床研究[3-4]發現人乳頭瘤病毒基因型有100余種，和生殖道感染相關的占到了40%，和腫瘤發生相關的占了20%，根據其致病能力的異同可將該類病毒分為高危型病毒和低危型病毒，該病毒和女性宮頸癌的發生有著極為密切的關系。低危型病毒可能導致濕疣和宮頸上皮內發熱低度病變，高危型人乳頭瘤病毒具有較高的致癌能力，主要包括HPV16、HPV18，已有的一些研究已經證實宮頸癌組織標本該類病毒的陽性檢出率超過90%，因此做好其診斷檢查對臨床治療具有重要的意義[5]。

3.2 兩種檢測方法

臨床研究[6-7]證實第二代雜交捕獲檢測對HPV具有較好的臨床檢測效果，隨著醫療診斷技術的不斷發展和進步，實時熒光PCR技術逐漸應用于臨床檢測。本研究對第二代雜交捕獲檢測和實時熒光PCR技術的檢測結果進行了比較，兩者的符合性達到82.35%，結果證明兩種手段在高危型宮頸病變的檢測具有較好的相關性；實時熒光PCR的靈敏性和特異性要略好于第二代雜交捕獲檢測，本次研究結果中實時熒光PCR總陽性檢出率也要顯著好于第二代雜交捕獲檢測，且對慢性宮頸炎和鱗狀上皮病變的HPV的檢測效率要顯著好于第二代雜交捕獲檢測，這些結果說明此種檢測方法對于臨床檢測和診斷HPV具有較好的效果，可以作為一種有效的檢測手段來對此種病毒診斷，實時熒光PCR的操作簡便有效，在縮短檢測時間的同時，大大提高了對人乳頭瘤病毒的診斷的有效性[8]。

綜上所述，實時熒光PCR和第二代雜交捕獲法都是臨床上檢測人乳頭瘤病毒的有效方法，兩者的HPV診斷相關性較高，實時熒光PCR具有較好的靈敏性和特異性，提高了診斷準確性，為宮頸類疾病的早發現和治療提供了可靠的依據。

[1]沈云岳，劉華，王蕾，等.實時熒光PCR和HC-Ⅱ檢測高危型人乳頭瘤病毒的臨床價值[J].山東醫藥，2010，50（5）：77-78.

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[4]賈政軍，周玉春，胡蓉，等.HPV mRNA實時熒光定量PCR檢測及其與宮頸癌發生的關系[J].實用預防醫學，2012，19（3）：354-358.

[5]杜娟，李曉強，劉躍.高危人乳頭瘤病毒檢測在實時多重熒光核酸擴增技術中的意義[J].國際檢驗醫學雜志，2012，33（4）：460-461.

[6]王鶴，于繼云，李力.實時熒光定量PCR檢測宮頸癌患者HPV病毒負載量的研究[J].廣西醫科大學學報，2012，29（2）：232-235.

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