電針對阿爾茨海默病大鼠海馬P K C和G DNF表達的影響

張海燕 劉忠錦 馮化杰 廉 潔 陳志偉 黃 健

1.齊齊哈爾醫學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院第一附屬醫院，黑龍江齊齊哈爾 161006

阿爾茨海默病是老年人常見的神經系統退行性疾病，主要病理特征為細胞外老年斑中β淀粉樣蛋白的沉積、細胞內由成對的過度磷酸化的Tau蛋白組成的神經原纖維纏結[1]，其病因及發病機制尚不清楚，多種治療方法目前正在探索中[2]。神經營養因子（NTFs）與神經系統疾病密切關系。而膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）是神經營養因子家庭中的一名新成員。關于電針治療AD大鼠海馬GDNF表達的方面比較少，本研究主要觀察電針對AD大鼠海馬PKC和GDNF表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組

清潔級健康Wistar大鼠45只，雄性，體重200～250 g，白求恩醫大實驗動物中心提供，合格證號2010002，經水迷宮測試篩選40只，隨機分為4組：正常組、模型組、西藥組和電針組，正常組常規飲水和飼料。其余3組大鼠均采用鏈脲霉素（STZ）所致AD模型，模型組造模后不治療。參照華興邦等[3]的大鼠穴位圖譜，電針組針刺雙腎俞（第二腰椎棘突下左、右側旁開7 mm）、雙足三里（腓骨小頭下約5 mm處）、百會（頂骨正中）、大椎（第七頸椎與第一胸椎間）[4]等穴治療，用 0.25×0.25 mm華佗牌無菌毫針針刺，連接KWD-808全能脈沖電療儀，電壓為2 V，頻率為30 Hz，，強度以肢體局部輕微顫動為適。西藥組采用氫溴酸加蘭他敏灌胃 0.5～1.0 mg/（kg·d），治療 4 周。

1.2 主要試劑和儀器

氫溴酸加蘭他敏，鏈脲霉素STZ（注射前將STZ溶于0.9%氯化鈉溶液）。PKC免疫組化檢測試劑盒（博士德生物工程有限公司），GDNF免疫組化檢測試劑盒 （博士德生物工程有限公司），腦立體定位儀，水迷宮，Hans電針儀，Olympus顯微鏡。

1.3 模型復制

10%水合氯醛4 mL/kg麻醉大鼠，在頭部做正中矢狀切口，坐標為腦表面下3.5 mm，前囟1.5 mm，矢狀縫左右旁開1.5 mm。在每側側腦室注射10%鏈脲霉素10 μL，創口縫合。3 d后重復注射一次。

1.4 各組大鼠標本的制備

大鼠治療4周后，麻醉后暴露出心臟，左心室插入灌注針頭，快速灌入無菌生理鹽水沖洗組織內血液，同時剪開右心耳，沖洗至肝臟變白，然后灌注4%多聚甲醛，當大鼠尾巴、四肢僵硬時斷頭取腦，分離海馬[5]。一側海馬裝入凍存管，一側置于4%多聚甲醛中，浸泡固定，取海馬標本，脫水包埋切片。

1.5 免疫組織化學染色大鼠海馬PKC和GDNF

PKC、GDNF免疫反應陽性產物為棕黃色點狀顆粒，主要分布在胞漿。采集免疫組化染色圖像，用Imagepro-Plus分析軟件進行圖像分析，每張切片區6個視野測定海馬組織中陽性細胞數，所得數據經SPSS 17.0系統處理，數據結果以均數±標準差（±s）表示。

2 結果

正常組、模型組PKC和GDNF蛋白有較高表達，模型組PKC和GDNF蛋白表達水平顯著降低，治療后西藥組、電針組與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 電針對海馬PKC和 GDNF表達的影響（±s，n=10）

表1 電針對海馬PKC和 GDNF表達的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，＊P＜0.05

組別 海馬PKC陽性細胞數（個/高倍視野）海馬GDNF表達陽性細胞數（個/高倍視野）正常組模型組西藥組電針組32.17±13.52＊16.26±3.58 28.34±10.68＊27.49±11.71＊96.31±8.94＊72.38±6.15 88.62±7.49＊86.73±7.65＊

3 討論

PKC是一類由多種同工酶組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，PKC參與學習記憶與影響長時程增強 （longterm potentiation，LTP）的形成有關，在神經細胞內PKC的激活參與了離子通道的調節、受體的失敏、神經遞質的釋放及突觸傳遞。PKC的激活是突觸可塑性及LTP形成的分子機制之一。Cordey M等[6]研究證明經典的PKC亞型能夠阻止Aβ誘導的神經細胞死亡。唐勇等[7]電針治療AD大鼠后發現，海馬PKC和酪氨酸蛋白激酶的活性發生變化，電針治療可能激活蛋白激酶信號通路，從而提高老年癡呆大鼠的學習記憶能力。星形膠質細胞能釋放膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）、神經生長因子（NGF）等大量的活性物質，可以防止神經元凋亡，促進神經元修復和神經生長。研究發現[8]電針治療后的AD大鼠神經營養因子家族重要成員的腦源性神經營養因子和神經膠質細胞源性神經生長因子表達也顯著增加。本實驗結果模型組大鼠海馬PKC、GDNF表達降低，經治療后電針組表達增加 （P＜0.05）。

中醫學認為老年性癡呆是由于陰陽、氣血、臟腑功能失調所引起的虛實夾雜的疾病，電針具有促進氣血運行，疏通經絡、調節平衡的特點[9]。本實驗顯示，電針刺激可激活PKC阻止神經細胞死亡，從而使膠質細胞高表達GDHF mRNA。對AD大鼠海馬GDNF mRNA表達有正向調節作用?？梢妼p壞的海馬神經元有修復作用，使AD大鼠癡呆癥狀得以改善。這可能是電針能有效地防治老年性癡呆的作用機制。

[1]朱曉冬，蔣希成，毛翔.針刺對D-半乳糖復制阿爾茨海默病模型大鼠腦組織中 β-AP、Tau 蛋白表達的影響[J].中醫學報，2011，26（8）：158-159.

[2]邱文興，賈博宇，劉永武，等.通天草提取物對 Aβ1-40所致 AD大鼠血清與海馬組織中細胞因子含量的影響[J].中醫藥信息，2012，29（2）：24-25.

[3]華興幫，周浩良.大白鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗，1991，（1）：1-5.

[4]沈峰，杜艷軍，孫國杰，等.電針對Aβ25～35所致AD模型大鼠海馬 cAMP 的影響[J].世界中西醫結合雜志，2012，7（2）：117-119.

[5]Xiao-Ping WANG，Hong-Liu DING.Alzheimer's disease： epidemiology，genetics，and beyond[J].Neurosci Bull，April，2008，24（2）：105-109.

[6]CordeyM，PikeC.Conventionalprotein kinase C isoforms mediate neuroprotection induced by phorbol ester and estrogen[J].Neurochem，2006，96（1）：204-217.

[7]唐勇，余曙光，劉旭光，等.電針激活老年癡呆大鼠海馬蛋白激酶信號通路的作用[J].中國臨床康復，2005，9（1）：124-125.

[8]馬駿，王彥春，王述菊，等.電針對阿爾茨海默病模型大鼠海馬區神經營養因子及其受體表達的影響[J].針灸臨床雜志，2010，26（7）：63-66.

[9]趙立剛、馬莉.針灸百會、大椎治療老年性癡呆的療效觀察[J].針灸臨床雜志，2007，23（9）：42-43.