葛根素干預對糖尿病腎病大鼠降鈣素基因相關肽的影響研究

龔志剛 宋春暉 石向群

1.江西師范大學體育學院，江西南昌 330022；2.江西師范大學生命科學學院，江西南昌 330022；3.九江學院基礎醫學院，江西九江 332000

降鈣素基因相關肽 （calcitonin gene-related peptide，CGRP）是1983年由國外學者Rosenfeld MG等[1]發現的一種具有復雜生物功能的活性多肽，是迄今為止所知的體內最強的內源性舒血管多肽，CGRP與糖尿病腎病的發生發展關系密切。許多研究證實，糖尿病患者血漿CGRP水平降低，且在合并糖尿病腎病時降低更明顯[2-4]。本文擬結合葛根素（puerarin）防治糖尿病的作用機理，通過對糖尿病腎病大鼠腹腔注射葛根素注射液，來觀察葛根素對血漿中CGRP的影響，為DN的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

葛根素注射液 （黑龍江哈爾濱醫大藥業有限公司提供，國藥準字 H20044142，批號：2010-03-12）；鏈尿佐菌素（STZ，美國Sigma公司），臨用前用檸檬酸緩沖液配成l%的STZ溶液；大鼠降鈣素基因相關肽（CGRP）試劑盒，內皮素（ET）試劑盒，尿微量白蛋白（U-mAIb）試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 儀器

GC-911γ放射免疫計數器（中國科技大學創新股份有限公司）、DNM-9602型酶標儀 （北京普朗新技術有限公司）、HH-8數字顯示恒溫水浴箱 （常州國華儀器公司）、便攜式血糖儀（日本京都公司）、DT-1001電子天平（江蘇常州衡器廠）、低速大容量離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 動物

6周齡Sprague-Dawley雄性大鼠40只，由南昌大學實驗動物中心提供，平均體重（220.0±15.6）g，單籠喂養，室溫20℃，相對濕度 50%，1 d 中光照∶黑暗時間為 12 h∶12 h，自由攝食飲水。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物建模 40只大鼠預養一周后，隨機選取一組10只為正常對照組，剩余30只空腹12 h，腹腔注射1%STZ-檸檬酸鈉緩沖液35 mg/kg體質量。對照組注射等量檸檬酸鈉緩沖液，依據72 h后尿糖+++～++++，尾靜脈采血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L者，確定模型建立。除去造模失敗及實驗過程中死亡大鼠，將糖尿病鼠22只納入本實驗。

1.4.2 分組 （1）正常對照組（CN組10只）：糖尿病鼠隨機分為；（2）糖尿病組（D 組 11 只）：（3）葛根素治療組（S 組11只），S組每只給予160 mg/kg/d葛根素注射液進行腹腔注射，CN組腹腔注射等容量0.9%氯化鈉溶液，均連續干預14周。

1.4.3 標本采集 第14周實驗終止時，各組大鼠在禁食的基礎上，用代謝籠收集24 h尿液，測定尿白蛋白含量，動物經乙醚麻醉后心臟取血。測試生化指標：（1）空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）采用便攜式血糖儀測定；（2）尿微量白蛋白（urinary microalbumin，U-mAIb）采用 ELISA 法測定；（3）內皮素（endothelin，ET）采用放免法測定；（4）降鈣素基因相關肽（CGRP）用放免法測定。

1.5 統計學方法

所有數據用SPSS 12.0軟件進行統計分析，實驗所得數據均以均數±標準差（±s）表示，各組均數之間均用單因素方差檢驗（one-way ANOVA）進行差異性比較，其中P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有高度統計學意義。

2 結果

2.1 糖尿病大鼠模型的建立

注射STZ后72 h，糖尿病組空腹血糖明顯升高 （P<0.01），空腹血糖均值達到19.51 mmol/L；葡萄糖耐量試驗：兩組大鼠禁食12 h后，按2 g/kg·BW葡萄糖進行灌胃，尾部微量取血，分別測0.5、1.0、2.0 h血糖。實驗組大鼠1 h血糖值達到高峰，2 h仍高；對照組0.5 h達到高峰，2 h恢復空腹水平，提示實驗組出現糖耐量異常，且實驗組大鼠空腹血糖≥16.7mmol，表明糖尿病大鼠造模成功。見表1。

表1 兩組大鼠血糖和葡萄糖耐量試驗結果（±s，mmol/L）

表1 兩組大鼠血糖和葡萄糖耐量試驗結果（±s，mmol/L）

注：與對照組比較，＃P<0.05，＃＃P<0.01

組別 空腹血糖 葡萄糖耐量試驗0.5 h 1 h 2 h對照組實驗組4.67±0.78 19.51±2.51＃＃7.82±1.29 27.31±2.53＃＃5.91±0.56 29.69±2.99＃＃5.06±0.40 24.02±3.57＃＃

2.2 葛根素干預對DN大鼠相關生化指標的影響

各組測得FBG、U-mAIb和ET值，D組和S組都較CN組顯著升高（P<0.05），經過14周葛根素干預后，S組較D組顯著下降（P<0.05）；而血漿CGRP值，D組和S組較CN組顯著下降（P<0.05），且 S組較 D 組明顯升高（P<0.05）。見表2。

3 討論

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病時腎臟病理改變中只有腎小球硬化癥的全身微血管并發癥之一，主要病理特征是腎臟高灌注、高濾過、腎小球基底膜增厚和系膜細胞增生及細胞外基質增生，導致彌漫性或結節性硬化，出現蛋白尿、高血壓、水腫、腎衰竭等變化，現臨床上已認定U-mAIb是DN診斷的標準之一[5]。CGRP是目前已知在體內作用最強的擴張血管活性多肽，其通過與腎臟血管床上CGRP受體結合，引起腎臟血管的舒張作用，且可抑制血管平滑肌細胞增殖，促進內皮細胞的增殖與修復[6]。另外CGRP可使腎小球系膜細胞舒展，從而增加腎小球濾過面積及濾過率，對腎臟血管具有強大的保護作用[7]。CGRP和U-mAIb的聯合檢測可能作為DN的監控指標。

表2 各組大鼠FBG、U-mAIb、ET和CGRP的變化（±s）

表2 各組大鼠FBG、U-mAIb、ET和CGRP的變化（±s）

注：與CN組比較，aP<0.05，與D組比較，bP<0.05

組別 只數 FBG（mmol/L）U-mAIb（μg/min）ET（pg/mL）CGRP（pg/mL）CN組D組S組10 11 11 5.20±0.63 20.54±1.76*16.65±2.3*#14.87±5.65 169.77±40.56*124.32±48.78*#59.59±23.13 112.43±27.66*88.96±24.26*#276.51±76.77 178.99±45.44*226.76±64.88*#

本實驗結果顯示，模型組大鼠U-mAIb升高，血漿CGRP降低，表明模型組已出現DN癥狀。DN體內持續的高血糖導致血管內皮細胞損傷，使ET分泌增加。ET作為血管活性多肽均可與腎臟相應受體結合，使腎小球毛細血管壓增加，從而導致尿蛋白漏出增加。而CGRP對ET具有生物學拮抗作用，已被學者證實[8]。

葛根素作為豆科葛根中提取的異黃酮類化合物，《本草綱目》記載其有生津止渴的功效，目前研究已證實葛根素對糖尿病有治療作用[9]。現代藥理研究表明，葛根素能降低血液黏度，抑制血小板凝集，降低血漿ET、血管緊張素Ⅱ及腎素活性，從而擴張微動脈，改善腎小球的缺血、缺氧及高凝狀態[10]；同時還可清除糖基化反應所產生的自由基，提高機體抗氧化能力[11]。本實驗通過14周葛根素干預后，DM大鼠U-mAIb顯著減少，ET下降明顯，CGRP較模型組明顯增加，從而延緩DN發生發展的病理進程。崔秀玲等[12]研究發現：DM模型組大鼠尿清蛋白排泄率顯著升高，且隨病程延長而增加，表明DM可以損傷腎小球，且隨病程的延長損傷加重。分別采用低、中、高劑量葛根素治療后，尿清蛋白排泄率較正常對照組有一定程度升高，但明顯低于中劑量組，提示葛根素對DM模型大鼠腎臟有較好的保護作用。本研究亦表明葛根素對DN有明顯的改善作用，其部分原因可能是通過提升CGRP的作用，拮抗或抑制ET的釋放，使腎臟血管舒張，改善微循環，減少U-mAIb的排放。但其具體的機制還待進一步研究。

[1]Rosenfeld MG，Mermod JJ， Amara SG，et al.Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing[J].Nature，1983，304（5922）：129-135.

[2]Helset E，Kjaeve J，Bjertnase L，et al.Acute alveolar hypoxia increase endothelin-1 releasebut decrease release of calcitonin gene-related peptide in isolated perfused rat lungs[J].Scand JCl in Lab Invest，1995，55（5）：369-376.

[3]胡玲，林小紅，張選均，等.血漿降鈣素基因相關肽與糖尿病微血管病變的關系[J].臨床心血管雜志， 1996，6（12）：383.

[4]王憲，孫威，刑立愚，等.糖尿病大鼠腸系膜動脈降鈣素基因相關肽釋放減少以及一氧化氮的作用[J].生理學報，1998，5（2）：206-211.

[5]Gross JL，Azevedo Mj，Silveiro SP， et al.Diabetic nephropathy： diagnosis， prevention，and treatment[J].Diabetic Care，2005，28（1）：164-176.

[6]Nozaki K，Okamoto S，Vemura Y，et al.Vaseular relaxation Proportion of Caleitonin gene-related Peptide and vasoaetive intestinal polypeptide in subarachnoid haemorrhage[J].J Neurosurg，1990，72：792-797.

[7]曹翠平.降鈣素基因相關肽、內皮素與糖尿病腎病的關系及干預治療的臨床意義初探[D].沈陽.中國醫科大學，2004：30.

[8]Wang Y，Wang DH.Prevention of endothelin-1-induced increases in blood pressure：role of endogenous CGRP[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287（4）：1868-74.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.廣州：廣東科技出版社，1995：297.

[10]蘇春暈.實用中藥藥理新編[M].蘭州：甘肅科學技術出版社，1997：179.

[11]龔志剛，朱篤，胡紅霞，等.葛根素對糖尿病大鼠血糖和抗氧化能力的影響[J].食品科學，2006，27（11）： 498-501.

[12]崔秀玲，王遠征，劉曉健.葛根素對糖尿病模型大鼠尿清蛋白排泄率的影響[J].醫藥導報，2010，：29（2）：163-164.