冠心蘇合膠囊大鼠含藥血清抗氧化損傷致心肌凋亡機制研究

張 曦， 宋君秋， 汪 云， 李 欣， 康 毅， 婁建石

(天津醫科大學基礎醫學院藥理教研室，天津300070)

冠心病是由于冠狀動脈固定性或動力性病變，致使血管管腔狹窄堵塞，引起心肌缺血缺氧或壞死的缺血性心臟病，是人類心血管健康的最大威脅。中醫藥治療冠心病在緩解患者癥狀、改善病理損傷方面表現出獨特的優勢。

冠心蘇合具有寬胸、理氣、止痛的功效，臨床用于治療冠心病心絞痛。本課題采用血清藥理學方法采集含藥血清，利用生物化學檢測手段探討冠心蘇合抗氧化損傷致心肌細胞凋亡作用機制，為臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物、試劑及儀器 冠心蘇合膠囊 (天津宏仁堂藥業有限公司，批號102009)、Hoechst染色試劑盒 (批號:KGA211)、BCA蛋白測定試劑盒 (批號:KGPBCA)、caspase-3活性測定試劑盒(批號:KAG203)均來自凱基生物有限公司、兔抗鼠多克隆抗體Bcl-2(批號:BS1511，Bioworld公司)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗 (批號:BS10350，Bioworld公司)、β-actin內參 (批號:AP0060，Bioworld公司)、兔抗鼠多克隆抗體Bax(批號20110910，ABcam公司，美國)、倒置相差顯微鏡 (型號:CK40-F200，Olympus公司生產，日本)、CO2孵箱 (型號:3111，Thermo Electron Corporation，美國)、酶標儀 (型號:Model680，BIORAD公司生產，美國)、熒光顯微鏡(型號:MF41，Olympus公司，日本)Western bloting相關耗材由BIORED公司提供。

1.1.2 動物 SD大鼠40只，雌雄各半，體質量230～280 g(軍事醫學科學院，動物合格證號0005984)。飼養條件:溫度 (22±2)℃;相對濕度40%～60%;光照周期，12/12 h，自由進食進水;SD新生乳鼠 (3 d內)，25只，雌雄不拘 (軍事醫學科學院，合格證號0005356)。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清與空白血清的制備 取40只SD種大鼠，隨機分為正常對照組10只，冠心蘇合組30只。冠心蘇合組大鼠灌胃給予冠心蘇合膠囊，800 mg/kg，給藥體積為10 mL/kg，每日兩次，連續給藥4 d。正常對照組灌胃給予等量生理鹽水，操作同上。末次給藥后1 h，無菌條件下，經腹主動脈充分取血，分離含藥血清。過濾除菌，分裝，置-20℃保存備用。

1.2.2 原代乳鼠心肌細胞分離培養及氧化損傷模型的確立 取新生3 d內的SD乳鼠15只，在超凈臺中剪下心臟，加入37℃ 孵育的混合消化酶液(0.05%胰蛋白酶和0.055%膠原酶Ⅱ溶液)將心肌組織消化成單細胞懸液，差速貼壁去除非心肌細胞，調整細胞密度至5×105/mL種于25 cm2細胞培養瓶中，同時以1×104/孔接種于96孔板內，加入BrdU，于37℃、5%CO2孵箱中孵育。細胞貼壁48 h后方可換液，待大部分心肌細胞有搏動時加入H2O2使其終濃度分別為 100、200、400 μmol/L，繼續培養1、2、4 h，確立最合適的H2O2損傷濃度和時間。

1.2.3 實驗分組 將培養的心肌細胞隨機分為陰性對照組、正常血清對照組、氧化損傷模型組、冠心蘇合高劑量組 (含藥血清原液)、中劑量組 (按含藥血清原液∶DMEM=3∶1配制)和低劑量組(按含藥血清原液∶DMEM=1∶1配制)，除陰性對照組外，各組細胞在給藥后2 h均加入終濃度為100 μmol/L 的 H2O2，繼續培養2 h。

1.2.4 MTT法檢測細胞存活率 培養結束后，各組細胞棄去原有培養基，加入 10 μL MTT(5 mg/mL)和90 μL無FBS高糖DMEM培養基，放入培養箱中繼續培養4 h后，小心吸取上清液，每孔加入150 μL DMSO，490 nm波長處檢測吸光度。細胞存活率 (%)=(OD檢測組/OD對照組) ×100%。

1.2.5 Hoechst33258染色形態學研究 取6孔板中穩定搏動2 d原代心肌細胞建立H2O2氧化損傷模型，取各濃度藥物作用于心肌細胞 (實驗分組與MTT相同)，在培養箱中37℃孵育1 h;棄去6孔板中液體，PBS洗細胞3次;4%甲醛于4℃固定細胞10 min;棄去甲醛，PBS洗細胞2次，自然晾干;每孔加入Hoeschst33258染料150 μL，避光染色10 min后水沖凈晾干;熒光顯微鏡觀察照相。

1.2.6 caspase-3活性的測定

(1)蛋白定量

根據BCA試劑盒要求繪制蛋白標準曲線;根據標準曲線定量蛋白。

(2)caspase-3檢測

吸取50 μL細胞裂解上清 (蛋白質量濃度為100 ～200 μg/mL);加入 50 μL 的 Reaction buffer;加入5 μL caspase-3 Substrate并于37℃避光孵育4 h;用酶標儀在波長400 nm測定其吸光值。通過計算OD誘導劑/OD陰性對照的倍數來確定凋亡誘導劑組caspase-3活化程度。

1.2.7 Western blot測定Bcl-2及Bax蛋白的表達收集各組藥物作用后的心肌細胞，裂解后BCA法進行蛋白定量;用loading buffer配制好上樣蛋白，100℃煮蛋白20 min，分裝，-20℃保存;根據蛋白分子量制備12%的分離膠和積層膠;上樣完畢后按照積層膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V電泳，待溴酚藍移至玻璃板最下端即可停止電泳。裝好轉膜裝置，恒流350 mA電轉2.5 h;按照marker指示切割目的條帶，室溫下封閉2 h;加入含兔抗小鼠多克隆抗體 (稀釋比例為1∶1 000)的一抗工作液，4℃過夜;TBST搖洗3次，10 min/次;加入鼠抗兔IgG抗體，25℃孵育2 h;TBST搖洗3次，將多余二抗洗凈，10 min/次;ECL超敏發光液處理目的條帶1 min，暗室中曝光，顯影，定影，待X光片干透即可掃描，用Quantity one軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

2 結果

2.1 冠心蘇合含藥血清對H2O2所致乳鼠心肌細胞損傷存活率的影響 與陰性對照組比較，H2O2處理時細胞存活率顯著降低 (P＜0.01)，與模型組比較，冠心蘇合含藥血清組細胞存活率均明顯提高(P＜0.01)，且呈劑量相關性 (見表1)。

表1 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷的原代乳鼠心肌細胞存活率的影響(±s，n=6)Tab.1 Viability of H2O2injured primary cultured cardiomyocytes after being treated by Guanxin Suhe-containing serum for different doses(±s，n=6)

表1 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷的原代乳鼠心肌細胞存活率的影響(±s，n=6)Tab.1 Viability of H2O2injured primary cultured cardiomyocytes after being treated by Guanxin Suhe-containing serum for different doses(±s，n=6)

注:與陰性對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，##P ＜0.01。

分 組 細胞存活率/%陰性對照組100模型組 33.16±4.99空白血清組 40.03 ±3.24＊＊冠心蘇合低劑量組 49.72±4.32＊＊##冠心蘇合中劑量組 70.75±3.95＊＊##冠心蘇合高劑量組 82.39±8.52＊＊##

2.2 Hoechst33258染色結果顯示 與模型組相比，空白血清組能稍微減少細胞核固縮凝聚，冠心蘇合各劑量組隨著藥物濃度升高細胞核固縮凝聚減輕，碎片依次減少，說明冠心蘇合各劑量組能夠有效的抑制細胞凋亡。

2.3 caspase-3活性的測定結果 與陰性對照組相比，H2O2處理使得caspase-3活性明顯升高 (P＜0.01);與模型組相比空白血清組變化不大;與模型組及空白血清組相比，caspase-3活性隨含藥血清濃度增高而降低，說明含藥血清能夠阻止caspase-3的激活，結果如表2。

2.4 Bcl-2及Bax蛋白的表達 Western blot檢測顯示，與陰性對照組相比，H2O2處理使得Bax蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調 (P＜0.01);與模型組相比，冠心蘇合給藥組能夠下調Bax水平，上調Bcl-2水平 (P＜0.01)且呈現劑量依賴性(見表3，圖1)。

表2 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷的心肌細胞caspase-3活性的影響(± s，n=6)Tab.2 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on caspase-3 activity in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2(± s，n=6)

表2 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷的心肌細胞caspase-3活性的影響(± s，n=6)Tab.2 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on caspase-3 activity in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2(± s，n=6)

注:與陰性對照組相比，＊＊P＜0.01;與模型相比，##P＜0.01;與空白血清組相比，▲▲P＜0.01。

組 別 (OD誘導劑/OD陰性對照)/%陰性對照組100.0±0.00模型組 160.8 ±18.1＊＊空白血清組 157.1 ±19.3＊＊##冠心蘇合低劑量組 140.4 ±17.3＊＊##▲▲冠心蘇合中劑量組 124.5 ±9.2＊＊##▲▲冠心蘇合高劑量組 118.9 ±11.6＊＊##▲▲

表3 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷心肌細胞Bax和Bcl-2表達的影響(±s，n=6)Tab.3 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on Bcl-2 and Bax expression in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2(±s，n=6)

表3 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷心肌細胞Bax和Bcl-2表達的影響(±s，n=6)Tab.3 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on Bcl-2 and Bax expression in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2(±s，n=6)

注:與陰性對照組相比，＊＊P＜0.01;與模型組相比，##P＜0.01;與空白血清組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組 別 ABcl-2∶Aβ-actin ABax∶Aβ-actin陰性對照組1.21±0.04 0.73±0.03空白血清組 0.81 ±0.05＊＊## 1.77 ±0.04＊＊##模型組 0.70±0.02＊＊ 1.88±0.01＊＊冠心蘇合低劑量組 0.75±0.04＊＊##▲▲ 1.62±0.02＊＊##▲▲冠心蘇合中劑量組 0.85±0.06＊＊##▲▲ 1.59±0.02＊＊##▲▲冠心蘇合高劑量組 1.07±0.05＊＊##▲▲ 1.37±0.03＊＊##▲▲

圖1 冠心蘇合含藥血清對H2O2損傷心肌細胞中Bax和Bcl-2表達的影響Fig.1 Effect of Guanxin Suhe-containing serum on Bcl-2 and Bax expression in primary cultured cardiomyocytes injured by H2O2

3 討論

冠心蘇合膠囊含有蘇合香、冰片、乳香、檀香、青木香等，具有芳香開竅、理氣止痛的功效［1］，是治療冠心病心絞痛、心肌梗死等疾病的驗方。國內學者［2-4］對此多有研究。但關于該方是否具有抗心肌細胞凋亡的作用研究鮮有報道。

應用血清藥理學方法其價值在于，一是克服了用中藥制劑直接進行體外實驗時，中藥制劑本身的理化性質對實驗的干擾;二是實驗結果與在體實驗有較好的一致性，不僅能反映中藥母體藥物及其可能的代謝產物的藥理作用，而且還能反映可能藥物誘導機體內源性成分所產生的作用，為從細胞分子水平研究中藥藥理學提供了新的手段［5］。

本實驗采用心肌細胞為研究對象，根據心臟在氧化損傷過程中氧化增強反應的原理，選用H2O2誘導細胞損傷，以模擬細胞病理模型。H2O2濃度在0.1～1 mmol/L范圍內就能引起培養的心肌細胞早期的生物化學改變 (LDH釋放，MDA生成和細胞周期的改變)。采用MTT法觀察冠心蘇合含藥血清對氧化損傷的心肌細胞存活率的影響，結果發現，冠心蘇合各劑量組能使損傷心肌細胞的存活率顯著上升，且具有明顯的劑量相關性，此結果表明冠心蘇合含藥血清對心肌細胞過氧化損傷存在著明顯的保護作用。

細胞凋亡最突出的特點是細胞凋亡起始于細胞核的改變，細胞核凋亡小體的形成即是細胞凋亡的主要形態學特征。本實驗將不同濃度冠心蘇合含藥血清作用于H2O2損傷后的原代心肌細胞后，經Hoechst 33258染色后發現:H2O2損傷模型組可見到明顯的凋亡細胞特征——細胞膜完整，細胞染色質斷裂聚集，固縮，可見到凋亡小體，符從冠心蘇合各劑量組凋亡小體隨濃度增加而減少。

Bcl-2家族是調控細胞凋亡的基因家族中最受重視的，分為抑凋亡基因和促凋亡基因兩類。基因轉染的實驗已證實，Bcl-2蛋白能阻止并能消除多因素介導的凋亡，說明Bcl-2基因處于凋亡調控的終末部分，其表達狀態可決定細胞的生存與死亡。Bax可誘導細胞色素C的釋放，激活caspase-3蛋白酶，引起細胞凋亡。細胞內Bax與Bcl-2的比例調節了凋亡的發生［7-8］。本實驗結果發現，冠心蘇合各劑量組可使模型損傷組細胞中Bcl-2水平上調，Bax水平下降，且呈現一定的劑量依賴性。由此可推測，冠心蘇合含藥血清可能是通過上調Bcl-2與Bax的比值，使Bax/Bax同二聚體減少對細胞凋亡起到抑制作用的。

在caspase家族成員中，caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的關鍵蛋白酶，是細胞凋亡下游的主要和關鍵執行者，是凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路［9-10］。本實驗用不同濃度冠心蘇合含藥血清處理H2O2損傷后的心肌細胞后發現，冠心蘇合含藥血清可阻止caspase-3途徑的激活，且呈一定劑量依賴性。

此外，CytoC、p-AKT/AKT、pERK/ERK等蛋白也可以從不同的通路驗證凋亡的發生。硫氧還蛋白 (TRX)為細胞內重要的氧化還原調節分子之一［11］，細胞缺氧時，TRX發生從胞漿到胞核的轉位，故檢測細胞裂解后懸液中TRX的表達也是探討藥物作用機制很好的指標。近年來文獻資料顯示，熱休克蛋白家族在心肌缺血再灌注損傷中有良好的保護作用，可明顯提高心肌細胞對缺血的耐受性，減少了心肌梗死的面積［12］。

［1］陳 銳.冠心蘇合丸臨床應用解析［J］.中國社區醫師報，2011，27(28):16.

［2］李春香，丁里玉，李 清，等.新冠心蘇合滴丸抗大鼠急性心肌缺血的實驗研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2008，19(2):109-111.

［3］李貽奎，張金艷，李連達.冠心蘇合丸原方及改進方對心肌細胞過氧化氫損傷的影響［J］.中成藥，2008，30(9):1279-1283.

［4］張金艷，李貽奎，李連達，等.冠心蘇合丸系列組方對心肌梗死模型大鼠心肌細胞凋亡及凋亡相關基因表達的影響［J］. 中成藥，2008，30(10):1528-1530.

［5］柯 瑋，朱建華.中藥血清藥理方法學的研究概況［J］.中國醫藥指南，2011，9(6):24-25.

［6］Irkin V，Joos S，Zornig M，et al.The role of Bcl-2 family members in tumorigenesis［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1644(2-3):229-249.

［7］Hideaki I，Takao K，Seiji K，et al.Microtubule inhibitor D-24851 induces p53-independentapoptotic cell death in malignant glioma cells through Bcl-2 phosphorylation and Bax translocation［J］.Int J Oncol，2005，26(3):589-596.

［8］Wu Lixin，Gu Xianfeng，Chun Yizhu，et al.Protective effects of novel single compound，Hirsutine on hypoxic neonatal rat cardiomyocytes［J］.Eur J Pharmacol，2011，650(1):290-297.

［9］Di Paola R，Mazzon E，Paterniti I，et al.Olprinone，a PDE3 inhibitor，modulates the inflammation associated with myocardial ischemia-reperfusion injury in rats［J］.Eur J Pharmacol，2011，650(2-3):612-620.

［10］Zhang C L，Wu L J，Tashiro S，et al.Oridonin induces apoptosis of HeLa cells via altering expression of Bcl-2/Bax and activating Caspase-3/ICAD pathway［J］.Acta Pharmacol Sin，2004，25(5):691-698.

［11］李小剛，羅開元，白 潔.硫氧還蛋白與腫瘤相關性的研究進展［J］.中華臨床醫學實踐雜志，2006，5(6):539-541.

［12］陳懷東，司忠義.熱休克蛋白70心肌保護的研究進展［J］.心血管病學進展，2010，31(2):312-315.