纈沙坦對尿酸性腎病大鼠腎間質纖維化的干預機制研究

孔翠文，閆 慧，李 靖，楊 堃，王 艷

尿酸性腎病是因血尿酸升高，尿酸鹽晶體在腎臟沉積引起的病變，可導致腎小管間質纖維化。研究表明，慢性缺氧是導致腎間質纖維化的重要因素［1］，目前尿酸性腎病大鼠是否存在缺氧狀態及纈沙坦對其缺氧狀態的影響少有報道。缺氧誘導因子－1α (hypoxia－inducible factor－1α，HIF－1α) 是組織缺氧時重要核轉錄因子，是缺氧的可靠標記物［2］。腎臟缺氧的基礎是腎小管周圍毛細血管 (peritubular capillaries，PTC)進行性減少［3］，而血小板反應蛋白 －1(thrombospondin－1，TSP－1)是強烈的抑制血管生成因子［4］。本研究通過酵母和腺嘌呤建立尿酸性腎病大鼠模型，觀察腎臟TSP－1、HIF－1α的動態表達，探討其是否存在缺氧機制及纈沙坦可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

1.1.1 實驗動物 雄性健康Wistar大鼠 (購于山東魯抗實驗動物中心)36只，體質量 (190±10)g，飼養于青島大學醫學院附屬醫院SPF級動物實驗房。

1.1.2 試劑 纈沙坦 (北京諾華制藥有限公司)，Trizol試劑、逆轉錄聚合酶鏈反應 (RT－PCR)試劑盒、Premix Ex Taq(大連寶生物工程有限公司)，兔抗大鼠HIF－1α、TSP－1多克隆抗體及DAB顯色試劑、Masson三色染色試劑盒 (福州邁新)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型 36只大鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為正常組、模型組和纈沙坦組，每組12只。用10%酵母飼料喂養和腺嘌呤100 mg·kg－1·d－1灌胃造模。纈沙坦組在造模同時加用纈沙坦30 mg·kg－1·d－1灌胃治療。正常組用普通飼料喂養，用與纈沙坦組等容積的蒸餾水灌胃。

1.2.2 標本收集與檢測 3組大鼠均在入組后第3周、5周時于代謝籠中留取24 h尿液，每組處死6只大鼠，內眥靜脈采血，摘取腎臟，稱重后縱切，一份固定于4%多聚甲醛溶液，常規石蠟包埋;另一份放入液氮中用于RT－PCR。全自動生化分析儀檢測血尿酸 (UA)、血肌酐 (Scr)。

1.2.3 腎組織病理 石蠟切片行常規蘇木素－伊紅染色法(HE)和Masson染色，于高倍鏡下，每張切片隨機采集10個腎皮質區域互不重疊的視野 (均不含腎小球和較大小動脈)，應用JD801形態學圖像分析系統Version 1.0分析，腎間質纖維化相對面積=腎間質陽性染色面積/腎小管間質總面積 (腎小管管腔除外) ×100%，并取平均值。

1.2.4 腎組織TSP－1 mRNA和HIF－1α mRNA水平檢測 根據Trizol說明書提取腎臟總RNA，并依據逆轉錄試劑盒說明合成cDNA。取 1 μl cDNA為模板進行 PCR擴增 (終體系20 μl)。引物序列及產物長度見表1。反應條件:預變性，95℃ 5 min，1個循環;PCR反應，98℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，40個循環，72℃終延伸10 min。PCR產物定量:產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化已錠染色，凝膠成像系統掃描DNA條帶，并應用Quantity One 4.6軟件分析灰度值。各組基因相對表達量以目的基因/β－actin的灰度比值來表示。

表1 RT－PCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT－PCR

1.2.5 腎臟免疫組織化學法檢查 常規脫蠟，SP法檢測腎組織TSP－1、HIF－1α表達，具體步驟按試劑盒說明書進行，以腎實質及間質細胞出現棕褐色顆粒為陽性著色，采集及分析切片圖像信息，方法同Masson染色，腎小管間質相對陽性面積=腎小管間質陽性染色面積/腎小管間質總面積 (去除腎小管管腔) ×100%。

1.3 統計學方法 應用SPSS 18.0統計軟件進行分析。計量資料數據以 (±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK法檢驗;兩指標間的相關性采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠的體質量及血生化指標水平 3組大鼠3周和5周時測得的體質量、UA、Scr水平比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。模型組和纈沙坦組與對照組比較，大鼠3周、5周時的體質量、UA、Scr水平間差異均有統計學意義 (P＜0.05);纈沙坦組與模型組比較，大鼠3周和5周時的體質量、Scr水平間差異均有統計學意義 (P＜0.01，見表2)。

2.2 腎臟病理學

2.2.1 病理改變 正常組大鼠腎臟基本正常，HE染色、Masson染色顯示膠原主要位于腎小管基底膜、Bowman囊等處(見圖1A、圖2A)。(2)模型組大鼠3周時腎小球輕度腫大，腎小管上皮細胞輕度萎縮并有空泡變性，間質可見大量單核細胞、淋巴細胞浸潤，可見藍染的膠原纖維;5周時可見尿酸鹽晶體，腎小管上皮萎縮，藍染膠原纖維明顯增多 (見圖1B、圖2B)。(3)與模型組相比，纈沙坦組腎臟尿酸鹽晶體明顯減少，纖維化程度減輕 (見圖1C、圖2C、表3)。

2.2.2 免疫組織化學 3組大鼠3周和5周時測得的腎臟HIF－1α、TSP－1表達量間差異均有統計學意義 (P＜0.05)。模型組、纈沙坦組的表達量均高于正常組，模型組的表達量亦高于纈沙坦組，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表3)。正常組腎臟HIF－1α僅在皮髓質交界處腎小管上皮細胞散在表達;模型組和纈沙坦組HIF－1α的表達量增加，主要位于腎小管上皮細胞和間質成纖維細胞、炎細胞的胞核和胞質 (見圖3)。正常組腎臟TSP－1僅少量表達于腎小球壁層和腎間質。模型組和纈沙坦組TSP－1的表達量增加，廣泛表達于腎小管上皮細胞的胞質 (見圖4)。

2.3 RT－PCR結果 3組大鼠3周和5周時RT－PCR測得的TSP－1 mRNA、HIF－1α mRNA表達量比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05)。模型組和纈沙坦組3周和5周時TSP－1 mRNA、HIF－1α mRNA的表達量均高于正常組，模型組3周和5周時TSP－1 mRNA、HIF－1α mRNA的表達量亦均高于纈沙坦組，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見圖5、圖6)。

圖1 5周后3組大鼠HE染色結果 (×200)Figure 1 HE staining of three groups at 5 week

圖2 5周后3組大鼠Masson染色結果 (×400)Figure 2 Masson staining of three groups at 5 week

圖3 5周后3組大鼠HIF－1α免疫組織化學結果 (×400)Figure 3 HIF－1α expression by immunohistochemistry of three groups at 5 week

圖4 5周后3組大鼠TSP－1免疫組織化學結果 (×400)Figure 4 TSP－1 expression by immunohistochemistry of three groups at 5 week

2.4 相關性分析 模型組大鼠3周和5周時腎組織TSP－1 mRNA與HIF－1α mRNA的表達分別呈正相關 (r值分別為0.821和0.736，P＜0.05)。

表2 3組大鼠的體質量及血生化指標水平比較 (±s)Table 2 Comparison of body mass and biochemical indexes of rats in three groups

表2 3組大鼠的體質量及血生化指標水平比較 (±s)Table 2 Comparison of body mass and biochemical indexes of rats in three groups

注:UA=血尿酸，Scr=血肌酐;與正常組比較，△P＜0.05;與模型組比較，▲P＜0.05

組別 只數 體質量(g)3周 5周UA(μmol/L)3周 5周Scr(μmol/L)3周 5周正常組 12 332±16 428±24 81±10 78±13 26± 7 28± 8模型組 12 288±24△ 242±37△ 135±32△ 124±14△ 112±27△ 177±23△纈沙坦組 12 301±25△▲ 345±29△▲ 133±19△ 127±18△ 82±15△▲ 138±21△▲F 值＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 383.60 160.01 41.22 136.50 214.58 172.98 P值

表3 3組大鼠Masson染色面積比及HIF－1α和TSP－1表達比較 (x ± s，%)Table 3 Comparison of Masson staining and expression of HIF－1α，TSP－1 in three groups

圖5 3組大鼠TSP－1 mRNA相對表達量Figure 5 Comparison of levels of TSP－1 mRNA of rats in three groups

圖6 3組大鼠HIF－1α mRNA相對表達量Figure 6 Comparison of levels of HIF－1α mRNA of rats in three groups

3 討論

腎間質纖維化是各種腎臟疾病進行性發展的共同轉歸，尿酸性腎病也不除外。腎間質纖維化機制目前認為是多種細胞因子參與的復雜過程。近年來PTC丟失及組織缺氧在腎間質纖維化中的作用日益引起人們的重視。研究表明，以小管間質病變為主的腎臟疾病由于水腫、炎癥等會直接影響血流和氧的供應［5－6］。HIF－1是由 HIF－1α 和 HIF －1β 組成的異二聚體復合物，HIF－1α在低氧環境中穩定表達［2］，是反映低氧狀態的敏感指標。本研究采用酵母和腺嘌呤建立尿酸性腎病大鼠模型，發現模型組大鼠腎臟HIF－1α表達水平明顯升高，表明尿酸性腎病大鼠腎臟存在缺氧狀態。

TSP－1是一種內源性的強烈抑制血管生成因子，且高表達于整個腎纖維化過程中［7］。本研究同時發現，模型組大鼠腎臟TSP－1表達水平亦明顯升高，且與HIF－1α的表達水平呈正相關。腎間質纖維化機制可能與TSP－1表達增加進而抑制血管生成，PTC密度減少，組織缺氧狀態加重有關。尿酸可激活腎素－血管緊張素系統 (RAS)，改變腎臟血流動力學，升高球內壓，并可直接促進腎臟纖維化進展［8］。血管緊張素受體拮抗劑 (ARB)因可降低血壓，減少尿蛋白而起到腎臟保護作用，臨床上常用于慢性腎臟病的治療［9－10］，但其分子機制尚未完全明確。研究發現血管緊張素Ⅱ可降低PTC密度，ARB奧美沙坦可以改善PTC減少引起的組織缺氧［11］。本研究結果發現，纈沙坦干預治療3周后，腎間質纖維化程度減輕，TSP－1、HIF－1α表達較模型組均有所降低;5周后腎間質纖維化程度明顯改善，TSP－1、HIF－1α表達較3周時升高，但均比模型組降低。本研究結果表明，尿酸性腎病大鼠腎間質纖維化與TSP－1表達增多導致微血管丟失，加重組織缺血缺氧有關。纈沙坦可能通過減少微血管丟失、改善腎臟缺氧狀態從而起到保護腎臟的作用。

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