ARK5和基質(zhì)金屬蛋白酶2在小細胞肺癌中的表達及其臨床意義

陶 蓉，邱世超，侯成浩，李夢云，宿 超，李 慧，王云甲，史立宏，張寶剛，鄭世良

浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的生物學特征之一，許多臨床醫(yī)生都關注到這一問題，并進行了不懈努力和探索，但針對惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移對策卻無明顯進展，目前其仍然是臨床治療失敗和死亡的主要原因。肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率已位居惡性腫瘤的第1位，并且仍呈上升趨勢。肺癌易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，5年生存率遠低于其他惡性腫瘤。2003年由 Suzuki等［1］發(fā)現(xiàn)的 ARK5(AMPK －related protein kinase 5)又稱NUAK1，是AMPK亞家族的成員，是Akt的下游信號分子。Akt被認為在腫瘤細胞的侵襲中具有關鍵作用［2－4］。ARK5作為Akt的下游信號因子，也被認為是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移相關蛋白。相關研究表明，ARK5在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、直腸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移中起到不同程度的作用［5－8］。基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP－2) 是十分重要的促進腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的因子，在相關的研究中證明ARK5能刺激MMP－2的表達并促進其分泌。目前，國內(nèi)外對ARK5在肺癌中的臨床研究較少，尚未發(fā)現(xiàn)相關報道。所以ARK5在肺癌患者癌組織中的表達及其臨床作用的研究十分必要。本研究檢測ARK5和MMP－2在小細胞肺癌 (SCLC)患者癌組織中的表達情況，同時分析了ARK5和MMP－2與SCLC患者臨床病理特征及預后的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2003年1月—2011年1月在濰坊市人民醫(yī)院、濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院、第二人民醫(yī)院經(jīng)纖維支氣管鏡、CT引導下經(jīng)皮肺穿刺活檢、手術切除并經(jīng)病理結果證實的SCLC患者106例的手術標本為SCLC組，其中男79例，女27例; ＜60歲54例，≥60歲52例;腫瘤直徑＜4 cm 60例，≥4 cm 46例;低分化21例，中分化70例，高分化15例;Ⅰ期54例，Ⅱ期16例，Ⅲ期32例，Ⅳ期4例;T1期+T2期80例，T3期+T4期26例;N0期72例，N1～3期34例。術前均未化療或放療，未給予CAPli等生物治療，取得標本后常規(guī)病理檢查，并明確診斷，且具備完整的臨床資料。另選取同時期其他疾病切除的肺組織標本40例為對照組，其中男29例，女11例; ＜60歲21例，≥60歲19例;病因:肺大皰18例，支氣管擴張13例，肺膿腫9例。兩組性別構成和年齡分布具有均衡性。

1.2 免疫組化檢測ARK5和MMP－2的表達 術后標本立即用10%甲醛固定，送達病理科，由病理科專門技術人員進行常規(guī)石蠟包埋、切片，每層切片厚度4 μm。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，應用免疫組化SP法 (免疫組化二抗SP試劑盒由北京中杉生物公司生產(chǎn)，兔抗人ARK5和MMP－2多克隆抗體由美國Sigma公司生產(chǎn))由專人按照試劑說明書嚴格進行操作。

1.3 結果判斷 由兩位具有豐富經(jīng)驗的病理科醫(yī)師閱片后共同決定。全部切片均采用雙盲法進行操作。發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)呈淺黃色、黃色或棕黃色即可判斷為ARK5和MMP－2陽性表達。操作時，通常都是隨機選擇10個高倍鏡視野 (400倍)，每個視野連續(xù)計數(shù)100個細胞，共計數(shù)1 000個細胞。最后表達以染色強度和陽性細胞率的得分之和進行判斷:強染色記3分，中等染色記2分，弱染色記1分，無染色記0分;另一方面陽性細胞率＜5%記0分，5% ～25%記1分，26% ～50%記2分，＞50%記3分。每例患者各項得分做好記錄，再將上述兩項得分相加做出判斷結果:≥3分為陽性，＜3分為陰性。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件包進行分析。計數(shù)資料采用 χ2檢驗或 Fisher精確檢驗;相關分析采用Spearman秩相關分析;單因素生存分析采用Kaplan－Meier生存曲線和Log－rank檢驗;多因素生存分析采用Cox多因素分析模型。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ARK5和MMP－2檢測結果 電子顯微鏡高倍鏡視野顯示，SCLC組織中，ARK5主要定位于細胞質(zhì)，正常肺組織中不表達;MMP－2主要定位于細胞質(zhì)和細胞膜，正常肺組織中主要為陰性表達，間質(zhì)細胞有少量表達 (見圖1)。SCLC組ARK5和MMP－2陽性率分別為67.9%(72/106)和65.1%(69/106)，對照組中分別為5.0% (2/40)和7.5% (3/40)，差異均有統(tǒng)計學意義 (χ2值分別為46.004和38.540，P＜0.05)。

2.2 ARK5和MMP－2的表達與SCLC患者臨床病理特征的關系 ARK5和MMP－2的陽性率與腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移及腫瘤分期有關 (P＜0.05)，而與性別、年齡無關 (P＞0.05，見表1)。

表1 ARK5和MMP－2的表達與SCLC患者臨床病理特征的關系Table 1 Expression of ARK5 and MMP－2 in SCLC patients and its correlation with the clinicopathologic features

2.3 ARK5和MMP－2相關性分析 經(jīng)Spearman秩相關分析發(fā)現(xiàn)，SCLC癌組織中ARK5與MMP－2呈正相關 (r=0.878，P＜0.001)。

2.4 生存分析 Kaplan－Meier生存曲線顯示，ARK5陽性組5年生存率為12.9%，陰性組為59.6%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=30.077，P＜0.001);MMP－2陽性組5年生存率為16.3%，陰性組為62.3%，差異有統(tǒng)計學意義 (χ2=24.405，P＜0.001，見圖2)。

注:A:正常肺組織ARK5的表達，B:SCLC癌組織ARK5的表達，C:正常肺組織MMP－2的表達，D:SCLC癌組織MMP－2的表達

圖2 Kaplan－Meier累計生存時間曲線分析Figure 2 Kaplan－Meier cumulative survival time curve analysis

2.5 Cox多因素回歸分析 以SCLC患者死亡為因變量，以ARK5、MMP－2、腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移、腫瘤分期為自變量 (見表2)，納入Cox多因素分析模型，結果顯示，ARK5、分化程度、腫瘤分期與SCLC患者的預后差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表3)。

表2 SCLC患者預后影響因素的賦值Table 2 Assignment of factors affecting the prognosis of SCLC patients

表3 SCLC患者預后影響因素的Cox多因素回歸分析Table 3 Cox variables of factors affecting the prognosis of SCLC patients

3 討論

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，影響肺癌患者預后的最根本的原因是肺癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，這也是困擾臨床醫(yī)生的主要問題，因此關于肺癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的研究得到了許多臨床醫(yī)生的廣泛重視。雖然，近年來對肺癌發(fā)展和演進過程中的癌癥相關基因研究進展較快，但肺癌確切的發(fā)病原因、發(fā)病機制，尤其是相關基因具體作用以及浸潤和轉(zhuǎn)移的機制仍不明確。

ARK5是AMP激活蛋白酶 (AMPK)亞家族的成員，是Akt的下游信號分子。文獻報道，ARK5在促進腫瘤的發(fā)生和抑制腫瘤細胞的凋亡過程中起到一定作用［9］;另外研究表明，Akt－ARK5途徑與腫瘤惡性程度及其浸潤和轉(zhuǎn)移都有密切關系［9－10］。相關研究已表明，ARK5不但在乳腺癌、卵巢癌的浸潤、轉(zhuǎn)移中起到不同程度的作用，而且在胰腺癌、直腸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移中也起到不同程度的作用［5－8］，但其在SCLC中的作用尚未見報道。本研究結果顯示，ARK5和MMP－2的異常表達均與SCLC的腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移和腫瘤分期密切相關，這與文獻報道基本一致［8］。提示ARK5和MMP－2參與了腫瘤的分化、增殖，尤其是侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究還顯示，ARK5和MMP－2的表達呈正相關，這就說明兩者有密切相關。生存分析顯示，ARK5和MMP－2的高表達均預示SCLC患者預后不良，其中ARK5是SCLC患者獨立預后危險因素。

降解破壞細胞外基質(zhì)和基底膜被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移各個階段中的關鍵步驟之一。MMPs作為一種重要的蛋白水解酶家族，可以降解細胞外基質(zhì) (ECM)和基底膜成分以及一些非基質(zhì)成分，從而改變腫瘤細胞的微環(huán)境，促進惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展，尤其是轉(zhuǎn)移和侵襲。

MMP－2是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤侵襲關系最為密切的一種MMPs，可激活MMP－9［11］，兩者均是最重要的MMPs家族之一，臨床上有重要的作用。胃癌的轉(zhuǎn)移侵襲已被證實與MMP－2和MMP－9的過表達密切相關［12－13］，這就為胃癌早期轉(zhuǎn)移提供了簡單實用的檢測方法，有利于胃癌的臨床治療。ARK5基因的過表達可通過調(diào)控 MT1－MMP的增加引起MMP－2基因的激活并刺激其分泌，這點已被Suzuki等［14］發(fā)現(xiàn)，從而證明了MMP－2是ARK5的下游信號分子。

盡管ARK5及MMP－2都被證實在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲中有一定的作用，但它們具體的作用機制及相互調(diào)控關系仍未完全闡明。Suzuki等［14］進一步猜測，由于癌組織血供不足和缺氧導致Akt的激活和AMP生成增加，進而激活ARK5，導致對營養(yǎng)饑餓的耐受和MT1－MMP產(chǎn)物的上調(diào)，激活了MMP－2，從而刺激了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

總之，SCLC癌組織中ARK5和MMP－2均過表達，與肺癌的浸潤、轉(zhuǎn)移、分化相關。因此，可以通過檢測ARK5和MMP－2的表達來判斷肺癌的轉(zhuǎn)移情況和預后，了解病情嚴重程度，尋求抑制ARK5高表達的方法，來抑制腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移，為腫瘤的靶向治療提供新的靶點，增加臨床療效，改善肺癌的不良預后，同時為腫瘤發(fā)病機制的研究提供新方法。

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