宮頸癌性別決定基因9基因啟動子區甲基化水平檢測對宮頸癌的價值研究

巫劍紅，田玉翠，萬治安，代蔭梅

宮頸癌的發病率僅次于乳腺癌，居女性惡性腫瘤第2位，是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一［1］。人乳頭瘤病毒 (human papillomavirus，HPV)感染被認為是宮頸癌病因學最重要的危險因素。但HPV感染只是宮頸癌發生的必需但不充分病因，即在宮頸癌的自然形成過程中尚需要其他輔助因素的參與，但其誘導宮頸癌變發生的分子生物學機制尚不明確［2］。近年來研究發現，很多基因的甲基化與宮頸癌的發生、發展密切相關，比如 p16、MGMT、PAX1 和 RASSF1A［3－5］。性別決定基因9(sex determining region Y－box 9，SOX9)最早是從一種性別反轉畸形的遺傳性疾病——Campomellic dysplasia(CD)患者中克隆得到的，是軟骨及其他組織包括中樞神經系統及泌尿生殖系統中的表達轉錄因子。SOX9可通過促進細胞凋亡而發揮腫瘤抑制作用，并可抑制癌胚抗原的表達［6］。目前研究表明，在膀胱癌［7］、濾泡性淋巴瘤［8］、套細胞淋巴瘤［9］和乳腺癌［10］等腫瘤中均可檢測到 SOX9基因啟動子區甲基化，本研究采用雙探針定量檢測宮頸脫落細胞SOX9基因啟動子區的甲基化水平，探索其作為分子標記物在宮頸癌診斷、治療和預后評估中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源 采集2010年3月—2011年1月首都醫科大學附屬北京婦產醫院正常宮頸脫落細胞標本 (正常宮頸組)和宮頸癌脫落細胞標本 (宮頸癌組)，各48例。正常宮頸組年齡25～65歲，平均 (39.5±9.5)歲。宮頸癌組年齡21～73歲，平均 (41.0±11.2)歲。按照宮頸癌的國際婦產科聯盟(FIGO)分期 (2009)宮頸癌患者中Ⅰ期20例、Ⅱ期22例、Ⅲ期6例，鱗狀細胞癌43例、腺癌5例，細胞學分級G1～G235例、G313例。所有標本經病理檢查確診。均無其他腫瘤罹患證據，術前未接受放、化療。

1.2 試劑與儀器 基因組DNA提取試劑盒 (博爾誠北京科技有限公司，Cat#K5016005);DNA甲基化檢測試劑盒 (博爾誠北京科技有限公司，Cat#K5082100);引物和探針 (由博尚生物技術有限公司合成);離心機 (Eppendorf，Centrifuge 5430R);PCR 儀 (Applied Biosystems，7500 Real Time PCR System)。

1.3 樣本采集 采用新柏氏液基薄層細胞學檢測收集系統采集標本。采集方法:擦去宮頸上的黏液，將宮頸刷插入子宮頸內，順時針方向旋轉5圈，采集宮頸鱗柱交界處及頸管的脫落細胞，將收集的細胞洗入保存液中。宮頸刷攪拌約10次，使細胞充分進入保存液。旋緊瓶蓋，做好標本標識，置于4℃冰箱保存。采用新建立的Taqman探針聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction，PCR)甲基化水平檢測方法，測定宮頸癌脫落細胞和正常宮頸脫落細胞中SOX9基因啟動子區甲基化水平。

1.4 定量PCR檢測 收集的標本置50 ml離心管，8 000 r/min離心15 min，棄去上清液，按基因組DNA提取試劑盒說明提取脫落細胞的基因組DNA。按照DNA甲基化檢測試劑盒說明書步驟對DNA進行亞硫酸鹽修飾，修飾后的DNA置于－20℃冰箱保存。定量PCR反應的引物及探針由博尚生物技術有限公司合成。PCR引物:上游引物5'－GTATTAATTATAGGAGYGGTTGG－3'，下游引物 5'－TCTATTCCAATTCCCCAAACC－3'，擴增片段長度為105 bp;探針:檢測甲基化SOX9基因的探針序列:Methy 5'－FAM－TTCGCGATACGGGGATTTGTTT－BHQ1－3';檢測非甲基化SOX9基因的探針序列:Unmethy 5'－HEX－TGGGAGTTTGTGATATGGGGATTTBHQ1－3'。PCR擴增采用羅氏PCR反應體系 (20 μl):2×LightCycler480 Probes Master(Roche Scientific，Cat#4887301001)10.0 μl，上下游混合引物 (10 μm)1.0 μl，探針 (5 μm)1.0 μl，dH2O 7.0 μl，DNA 模板 1.0 μl。反應條件:94℃ 3 min;(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s) ×45個循環。PCR擴增時以正常宮頸脫落細胞DNA樣本作正常對照，以等量去離子雙蒸水代替模板DNA作陰性對照。

1.5 甲基化水平的表示方法 臨床宮頸癌脫落細胞樣本中除了含有腫瘤細胞，還含有炎癥細胞、血管內皮細胞、結締組織等非腫瘤細胞。因此脫落細胞DNA同時存在來自腫瘤細胞甲基化的SOX9基因和來自非腫瘤組織非甲基化SOX9基因。為了定量獲得組織樣本SOX9基因啟動子區甲基化和非甲基化的比率，采用了甲基化分值 (methylation score，MS)來表示甲基化水平:

1.6 統計學方法 采用SPSS 13.0統計包進行數據處理。計量資料以 (±s)表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組MS比較 宮頸癌和正常宮頸脫落細胞樣本的SOX9基因啟動子區平均 MS分別為 (47.7±24.7)和 (11.4±5.0)，差異有統計學意義 (t=10.048，P=0.000)。

2.2 宮頸癌病理特征與MS的關系 宮頸癌組中鱗癌SOX9基因啟動子區MS高于腺癌，G3高于G1～G2，有淋巴結轉移的高于無淋巴結轉移的，有脈管癌栓的高于無脈管癌栓的，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表1)。

表1 宮頸癌病理特征與MS的關系Table 1 Relationship between pathological features and MS in cervical cancer

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要研究內容，其在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要作用。在真核生物基因組中約80%的CpG位點被甲基化，這些甲基化主要發生在基因啟動子區域的CpG島［11］。DNA甲基化異?？赏ㄟ^影響染色體結構以及癌基因和抑癌基因啟動子區表達而參與腫瘤的形成。抑癌基因的啟動子區甲基化與某些腫瘤的臨床分期和病理特征緊密相關，逐漸成為腫瘤診斷、治療和預后評估的分子標志物［12－13］。

目前檢測基因啟動子區甲基化大多采用甲基化特異性PCR法［14］和熒光定量PCR［15］。本研究針對靶基因 SOX9基因啟動子區甲基化狀態和非甲基化狀態各設計了Taqman探針，利用雙探針在同一個反應管中測定SOX9基因啟動子區甲基化和非甲基化狀態的比例，建立了評估SOX9基因啟動子區甲基化水平的一種定量檢測方法。

SOX9是軟骨細胞及多種組織如中樞神經系統和泌尿生殖系統組織的轉錄因子［16－17］。SOX9可區分間質軟骨肉瘤和其他骨細胞腫瘤［18］，可調節維甲酸類介導的乳腺癌細胞的生長［19］。在前列腺癌、乳腺癌、結腸癌和膀胱癌中發現SOX9的腫瘤抑制作用［6，19－21］。SOX9基因啟動子區甲基化的研究有助于了解SOX9在這些腫瘤中參與腫瘤抑制和腫瘤進展的分子生物學機制。本研究也顯示，宮頸癌標本的SOX9基因啟動子區MS就明顯高于正常宮頸標本，提示甲基化SOX9可能用于宮頸癌的分子生物學診斷。

另外本研究還顯示，在宮頸癌組中SOX9基因啟動子區MS宮頸鱗癌中高于腺癌，且高細胞學分級比低細胞學分級高，有淋巴結轉移和有脈管癌栓的明顯高于無淋巴結轉移和脈管癌栓的，提示SOX9基因啟動子區甲基化與宮頸癌的發病機制密切相關，且可能作為宮頸癌預后不良的分子標記物。這與國外學者在其他腫瘤中對SOX9基因啟動子區甲基化的研究結果相同。Aleman等［7］對101例膀胱癌的研究中發現SOX9基因啟動子區甲基化發生在56.4%的膀胱癌中，是膀胱癌的頻繁事件，具有腫瘤特異性。Sun等［22］在胃癌中研究發現SOX9基因啟動子區甲基化程度與胃癌分期、血管浸潤、淋巴結轉移和人類皰疹病毒感染呈正相關。Enjuanes等［9］研究發現在套細胞淋巴瘤中SOX9基因啟動子區甲基化水平高與腫瘤細胞增殖速度快、染色體異常和患者生存時間短呈正相關，提示SOX9基因啟動子區甲基化可作為胃癌預后的分子標記物。而本研究發現，SOX9基因啟動子區甲基化與宮頸細胞學分級、有無淋巴結轉移和脈管癌栓密切相關，而這三者對于宮頸癌的進一步治療如再次手術、放療和化療等具有重要的指導意義，因此SOX9基因啟動子區甲基化可用于指導宮頸癌的治療。

SOX9基因啟動子區甲基化不僅與宮頸癌的發生、發展密切相關，還可以用于指導宮頸癌的診斷、治療和預后評估。甲基化SOX9可能為未來宮頸癌的治療靶點之一。本研究建立的DNA甲基化雙探針技術平臺，只要更換引物和探針，還可以方便地應用于其他基因的甲基化檢測，為臨床標本的分子生物學研究提供了可靠的技術支持，是甲基化檢測未來的發展方向。

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